楊顯超王 建葛菲菲徐 鋒沈莉萍劉永杰劉佩紅

(1.上海市動物疫病預(yù)防控制中心,上海 201103；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,江蘇南京 201195)

副豬嗜血桿菌菌體蛋白雙向電泳技術(shù)的建立

楊顯超1王 建1葛菲菲1徐 鋒1沈莉萍1劉永杰2劉佩紅1

(1.上海市動物疫病預(yù)防控制中心,上海 201103；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,江蘇南京 201195)

目的：建立副豬嗜血桿菌全菌蛋白二維雙向電泳技術(shù)，獲得分辨度高、重復(fù)性好的雙向電泳圖。方法：利用適當?shù)牧呀庖禾幚砀必i嗜血桿菌，提取菌體蛋白；利用pH梯度等電聚焦對菌體蛋白進行二維電泳；然后采用考馬斯亮藍染色，得到的電泳圖譜用Image Master 2D Elite 5.0 圖像分析軟件進行分析，得出的數(shù)據(jù)用SPSS15.0 進行統(tǒng)計分析。結(jié)果：得到了（1 081±16）個蛋白斑點，蛋白主要集中在pI 4.24～7.20 之間，重復(fù)膠的匹配點數(shù)為（1057±28），匹配率為97.85%。結(jié)論：建立了副豬嗜血桿菌的全菌雙向電泳分析方法，2-DE 圖譜中蛋白位點的分辨率和重復(fù)性非常高，獲得了較為理想、清晰的雙向電泳圖譜，為進一步研究其蛋白質(zhì)組學(xué)奠定了基礎(chǔ)。

副豬嗜血桿菌 雙向電泳 蛋白質(zhì)組學(xué)

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）隸屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，是豬上呼吸道的一種共棲菌，在特定條件下可引發(fā)豬嚴重的全身性疾病，主要引起豬纖維素漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。該菌較多的與諸如豬藍耳病、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟等混合感染，嚴重危害了青年豬和仔豬的健康。

近年來，由于該病頻發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，因此，備受業(yè)界專業(yè)技術(shù)人員等的關(guān)注。過去，人們在副豬嗜血桿菌的分子生物學(xué)、毒力、致病機理與致病性等方面的研究中取得一些成績，但是對副豬嗜血桿菌的致病機理模糊不清。即一些研究者在如何確定和描述可能的毒力因素等方面裹足不前。本課題采用雙向電泳技術(shù)，構(gòu)建起副豬嗜血桿菌全菌蛋白分離技術(shù)。以期為了解副豬嗜血桿菌其主要蛋白表達的變化，差異性表達蛋白的篩選及功能研究奠定基礎(chǔ)[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

血清型為5型HPS上海分離株SH08-54P為上海市動物疫病預(yù)防控制中心細菌室保存。

1.1.2 主要試劑和主要儀器

實驗中所提及的材料按照文獻[2]所提示的步驟來配置和購買。

主要試劑：腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基，哥倫比亞培養(yǎng)基，分別購自北京陸橋公司與OXOID公司。尿素、DTT、低熔點瓊脂糖、NAD、Tris堿、硫脲、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、丙烯酰胺、TEMED為Promege公司產(chǎn)品，CHAPS、SDS從Amresco公司購買，ImmobilineTM pH3-10、pH4-7 IPG預(yù)制膠條均為美國GE公司產(chǎn)品。蛋白定量試劑盒、考馬斯亮藍（R-350）均購自AMERSHAM公司。PBS、無水乙醇、異丁醇、乙酸、溴酚藍、甘油、TCA、丙酮為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：ImageScanner掃描儀、ImageMaster 2D Platinum 6.01圖像分析軟件來自Amersham Biosciences公司；IPGphor、分光光度儀為Hitachi公司；電泳儀（SE-600全套電泳設(shè)備）來自Amersham公司；純水裝置為Millpore公司；光密度掃描儀（GS-710）為Bio-Rad公司；冷卻水循環(huán)系統(tǒng)為Cole-Parmer公司；超聲細胞破碎儀為國產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)

據(jù)Elena[3]和Hill[4]等的報道，因為豬只發(fā)病時體溫一般會有所升高，我們選擇了高溫等四種條件來模擬該菌在豬體內(nèi)的生長環(huán)境。我們采取模擬體內(nèi)發(fā)病時的體外生長環(huán)境：首先，挑取在巧克力培養(yǎng)基上單個生長良好的菌落接種到含200 ml腦心浸液培養(yǎng)基中，其中，一瓶在正常條件下培養(yǎng)，另一瓶在特殊條件下培養(yǎng)。特殊條件為首先往培養(yǎng)基中添加200mM，2-2’-聯(lián)吡啶和醋酸鈉；其次，把培養(yǎng)基放在40℃高溫條件下和微需氧條件下培養(yǎng)。

1.2.2 提取菌體蛋白

把兩瓶副豬嗜血桿菌培養(yǎng)到對數(shù)生長期，然后在4℃，6 000 r/min離心10 min，接下來用預(yù)冷PBS清洗3次，最后收集菌體。取0.2 g菌體按照1：4 的比例放入配制好的裂解緩沖液中勻漿；室溫靜置30 min，4℃ 15 000 r/min 離心60 min，最后用超聲儀對其進行超聲，最后，上清即為粗提的菌體蛋白。用2-D clean-up kit純化粗提的菌體蛋白，方法按2-D clean-up kit 試劑盒操作指南進行。我們利用Bradford法蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)的濃度，根據(jù)試驗需要的蛋白量即1mg/管用1.5mlEP管分裝，在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 二維雙向凝膠電泳

主要按照Gorg 等[3]方法和Bio-Rad 儀器操作手冊進行。

第一相等電聚焦（IEF）：上樣量總體積為0.25ml（其中，含有總蛋白質(zhì)為100 ug）。電壓30 V重泡脹12 h后進行等電聚焦，依次經(jīng)過500 V 1 h、1 000 V 1h、8 000 V 3 h、10 000 V 至總電壓積為80 000 Vh。等電聚焦結(jié)束后取出IPG膠條，放于平衡液1（6 mmol/L 尿素，2% SDS，pH 8.8 50 mmol/L Tris-HCl，30%甘油，0.2% DTT）和平衡液2（6mmol/L尿素，2%SDS，50 mmol/L Tris-HCl pH8.8，30%甘油，3%碘乙酰胺，溴酚藍）中各平衡15min。第二相垂直板SDS-PAGE 電泳，步驟為將平衡好的膠條轉(zhuǎn)入垂直電泳槽中進行第二相電泳，聚丙烯酰胺凝膠濃度為12.5%；電泳條件為每膠12mA電泳30min，然后每膠20 mA恒流，直至溴酚藍指示線到達凝膠底部為止。

1.2.4 考藍染色

參考Amersham Biosciences實驗手冊和BIO-RAD雙向電泳實驗流程方案進行。用10mg的考藍溶解于95%乙醇中，與10ml 85%磷酸混合，定容到100 ml可于4℃保存數(shù)周，試驗前用濾紙過濾。染色液200ml 4～6h脫色液200 ml 2～3 h低甲醇脫色液200 ml 4～6 h或過夜保存于室溫蒸餾水中。

1.2.5 膠塊掃描及圖譜分析

利用Image Scanner Ⅱ型透射掃描儀及LabScan 掃描軟件對凝膠進行圖像掃描。得到的雙向電泳圖通過ImageMaster 2D Elite 5.0圖像分析軟件進行分析，得到的數(shù)據(jù)在SPSS15.0軟件上統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 利用pH3-10的膠條進行電泳的試驗結(jié)果

提取副豬嗜血桿菌的菌體蛋白，首先，使用13 cm pH3～10 IPG膠條觀察情況。

圖1

圖2

2.2 利用pH4-7的IPG干膠條進行雙向電泳的試驗結(jié)果

首先，采用裂解液裂解副豬嗜血桿菌菌體，然后提取該菌的菌體蛋白，為了讓試驗結(jié)果具有很好的可重復(fù)性，在相同條件下，對總蛋白同時進行3次雙向電泳分離，染色后得到正常培養(yǎng)條件下和經(jīng)過誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌雙向電泳圖譜3張（圖2，圖3）。利用Image Master 6.0圖像軟件分析副豬嗜血桿菌的雙向電泳蛋白圖譜，同時利用軟件對蛋白質(zhì)電泳圖譜進行斑點檢測和匹配，并結(jié)合人工校正分析，得到以下結(jié)果：

（1）用線性范圍pH4～7 IPG干膠條進行雙向電泳分離蛋白，凝膠染色后進行圖像掃描分析，如圖2、3所示，我們檢測到2000個左右的蛋白點。這些蛋白點都位于pH4～7范圍內(nèi)。這些圖譜非常類似，從這可以說明這是重復(fù)性很好的方法。所獲得的圖都非常清晰，蛋白樣品得到了較好的分離，并且都沒有明顯的拖尾現(xiàn)象，圖譜中各個部位的點都呈相似的規(guī)律分布，可同時滿足蛋白點檢測和差異比較分析的要求。

（2）對正常培養(yǎng)條件下與誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下的副豬嗜血桿菌蛋白質(zhì)表達圖譜匹配后發(fā)現(xiàn)：兩組圖譜中有43個蛋白質(zhì)點的表達存在明顯差異（即蛋白質(zhì)差異表達量在1.5倍以上），其中15個蛋白差異表達量在3倍以上，6個蛋白質(zhì)差異表達量完全不同。

圖2 正常副豬嗜血桿菌雙向凝膠電泳結(jié)果

圖3 模擬致病的副豬嗜血桿菌雙向凝膠電泳結(jié)果

3 討論

副豬嗜血桿菌是一種豬上呼吸道的常在菌，在特殊條件下進入豬體內(nèi)引發(fā)嚴重的疾病，主要臨床特征是纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎[5]。目前，該病的致病機理和毒力因素還不是很明確。因此，增強對該菌致病機理的了解，找出該病的毒力因子是非常有意義的。國際上關(guān)于這方面的研究有兩個著名的試驗，都是為了找尋該菌差異表達的基因。一個試驗是利用反轉(zhuǎn)錄差異顯示技術(shù)，Hill等[4]研究證實了在高溫條件下，有7個基因表達發(fā)生了變異。另外一個試驗是運用基因芯片技術(shù)，Melnikow等[2]探索在高溫，缺氧，缺鐵和酸性條件下，有75個基因表達發(fā)生了變異。另外，金卉[6]運用轉(zhuǎn)錄序列選擇性捕獲技術(shù)，鑒定出該菌在感染豬肺組織中，在體外缺鐵和高溫條件下，113個基因表達發(fā)生變化。繼而對其中部分基因編碼的蛋白質(zhì)的免疫原性和與宿主腦組織的相互作用進行了研究。以上這些研究都是為了研究該菌在體外條件下，模擬體內(nèi)環(huán)境基因表達的差異。這些試驗結(jié)果帶給我們很多有待研究的信息。因而，在本課題中，我們把注意力集中到該菌在體外模擬發(fā)病豬體內(nèi)條件來獲取差異表達的基因。

豬只在感染該桿菌時，一般會出現(xiàn)發(fā)燒，缺鐵等臨床癥狀，并且高溫條件已經(jīng)被證實了是重要的影響因子，是關(guān)于眾多微生物生長的許多外部因素的。環(huán)境溫度的改變會影響細菌的生長，所以，病原菌得以繁衍的一個最基本的條件是高溫條件。另外，鐵元素被證實是幾乎所有生物體所必須，在3種能量的代謝過程中起到了舉足輕重的作用。然而，機體內(nèi)含有轉(zhuǎn)鐵蛋白，游離的鐵離子是不能夠支撐細菌在機體中的生長[7]。所以，對于病原體來說，機體沒有可用游離的鐵離子，影響其生長。因而，本研究采用高溫和鐵兩種條件來模擬體內(nèi)發(fā)病情況。

二維雙向電泳的樣品準備過程是非常有用的，最好的情況是獲得無雜質(zhì)、高純度和無污染的蛋白。樣品制備環(huán)節(jié)包括蛋白質(zhì)的提取和處理。所以，本文采用的裂解液中含有能提高蛋白質(zhì)的溶解度的硫脲和DTT。裂解液中應(yīng)當添加去垢劑CHAPS，就是為了確保樣品能盡可能的溶解和防止蛋白質(zhì)聚在一起的現(xiàn)象。因為蛋白樣品中存在核酸，就可能會堵塞膠塊的孔徑，使得蛋白聚集在酸性一端，繼而會影響圖譜。為了盡可能地破除細菌的核酸，我們在裂解細菌時，應(yīng)配合使用超聲。

為了初步了解我們的蛋白樣品，我們首先利用線性梯度pH3～10的膠條，觀察出蛋白的等電點。因此，本實驗預(yù)實驗用線性梯度pH3～10的膠條先進行實驗，知曉樣品蛋白的pH范圍，通過圖1我們可以觀察出樣品的pH范圍在酸性端之間。繼而本課題用pH4～7線性梯度的膠條進行正式實驗，構(gòu)建出了高質(zhì)量的圖譜，為了試驗?zāi)軝z測到低豐度蛋白質(zhì)，并準確鑒定蛋白質(zhì)，我們的二維電泳圖譜上的單個蛋白質(zhì)分離率達到90%以上。

樣品的上樣量是本實驗中另外一個比較重要的因素，直接決定了結(jié)果的成功與否。電泳結(jié)果圖譜上蛋白點表現(xiàn)不足說明上樣量太低，最后得到的蛋白質(zhì)組學(xué)的信息量受到影響。反之上樣量太高，很可能有部分蛋白在聚焦的過程中在膠條槽中沉淀，并且還有可能堵塞膠孔，使第一向聚焦受到影響。不同物種的樣品、膠條的pH值、染色方法、膠條長度等因素影響著上樣量的多少。另外，影響等電聚焦的電壓是蛋白樣品中鹽類分子濃度使蛋白質(zhì)分子不能準確的聚焦，導(dǎo)致圖譜上出現(xiàn)橫紋和拖尾現(xiàn)象。本試驗采用的2D Clean- Up Kit試劑盒，有兩方面優(yōu)點：一方面，可以去除蛋白樣品中的鹽分、脂類、糖類等非蛋白成分，另外一方面，也可以避免蛋白丟失。最后，為了更加有效地除去鹽類對等電聚焦的影響，在設(shè)置等電聚焦程序時可以延長了低電壓時間。

本課題對細菌裂解液配方、樣品處理方法、上樣量大小和膠條選擇等幾個方面的試驗進行優(yōu)化，構(gòu)建起一套適合副豬嗜血桿菌蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)，即以裂解液配合超聲裂解細菌來提取樣品，接下來用100μg蛋白上樣，并結(jié)合適宜的電泳IEF參數(shù)，選用適合的膠條，獲得了高分辨率的電泳圖譜，為后續(xù)鑒定蛋白提供很好的基礎(chǔ)。

[1] Zou Q，Yan X，Li B，et al. Proteome analysis of sorbitol fermentation specific protein in Vibrio cholerae by 2-DE and MS [J] . Proteomics，2006，6（6）：1848- 1855.

[2] 張愛玲.2型豬鏈球菌強毒株與無毒株胞外蛋白的比較蛋白質(zhì)組研究[D].吉林大學(xué)，2007.

[3] Elena Melnikow，Saffron Dornan，Carole Sargent，et al. Microarray analysis of Haemophilus parasuis gene expression under in vitro growth conditions mimicking the in vivo environment[J]. Veterinary Microbiology，2005，（110）：255-263.

[4] Hill C E，Metcalf D S，Maclnnes J I. A search for viruLence genes of hamophilus parasuis using differential display RT-PCR[J]. Vet Mic，2003，96（2）：189-202.

[5] Little T.W.A.. Haemophilus parasuis infection in pigs[J]. Veterinary Record，1970，（87）：399-402.

[6] 金卉.副豬嗜血桿菌感染和應(yīng)激相關(guān)基因的鑒定與功能研究[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009

[7] Westbrook JA，Yan JX，Wait R，et al. Zooming in on the proteome：very narrow-range immobilized pH gradients reveal more protein species and isoforms. Electrophoresis，2001，（22）：2865-2871.

滬農(nóng)科攻字（2014）第7-3-3號

楊顯超（1985-），男，江西九江人，碩士研究生，主要從事動物傳染病學(xué)研究。