楊美榮馬超越

(焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心,河南焦作 454003)

實時熒光PCR技術(shù)檢測飼料中沙門氏菌的應(yīng)用研究

楊美榮*馬超越

(焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心,河南焦作 454003)

本研究建立了以DNA為基礎(chǔ)的熒光定量PCR方法對飼料中的沙門氏菌進(jìn)行檢測，分別對兩種非沙門氏菌菌種進(jìn)行熒光PCR檢測，結(jié)果均為陰性，表明本方法特異性強；并通過對空白飼料、人工污染飼料和自然感染飼料進(jìn)行熒光PCR檢測和國標(biāo)方法檢測相比較，結(jié)果均與國標(biāo)方法相一致，且可以大大縮短檢驗時間。

飼料 沙門氏菌 熒光定量PCR

沙門氏菌是一種嚴(yán)重威脅人類及動物生命健康的人畜共患的腸道病原菌，可引起人和動物急性胃腸炎、傷寒、敗血癥以及腸外灶性感染等[1]。在世界各國的各類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常高居榜首。由于沙門氏菌很容易在自然環(huán)境及動物體內(nèi)存活和增殖，而且飼料原料（包括動物性及植物性原料）、飼料的粉碎加工及打包過程中都會引進(jìn)沙門氏菌而污染飼料。因此準(zhǔn)確快速地檢測飼料中的沙門氏菌，不僅是發(fā)展畜牧業(yè)的需要，而且是減少人類沙門氏菌中毒的需要，對于畜禽健康、食品安全以及公共衛(wèi)生都具有重要的意義。

目前，沙門氏菌的檢測大都沿用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)、生化反應(yīng)、血清學(xué)實驗等方法，費時費力，從分離到鑒定需4-7d，而且操作煩瑣，難以適應(yīng)快速簡便的要求，因此，有必要建立快速靈敏的檢測方法為保障食品安全提供有效的檢測工具。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是近十多年來應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)方法，黃金林等[2]建立了應(yīng)用PCR進(jìn)行沙門氏菌快速檢測的方法。目前，常規(guī)PCR方法已經(jīng)衍生出許多新的PCR檢測技術(shù)如多重PCR檢測技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄PCR和實時熒光定量PCR等，并越來越多的應(yīng)用于沙門氏菌的檢測與鑒定。實時熒光PCR法在進(jìn)出口食品檢測中已有應(yīng)用，但在飼料微生物的檢測中應(yīng)用很少。本研究建立了以DNA為基礎(chǔ)的熒光定量PCR方法，并對來自焦作市的飼料進(jìn)行了沙門氏菌檢測，為預(yù)防食源性沙門氏菌感染提供借鑒材料。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器設(shè)備

1.1.1 被檢材料

10批空白畜禽飼料樣品，3批自然污染飼料樣品，均來自焦作市隨機(jī)抽檢飼料；沙門氏菌菌種由河南省畜產(chǎn)品質(zhì)檢中心提供。

1.1.2 主要試劑

緩沖蛋白胨水增菌液（BP），氯化鎂-孔雀綠增菌液（RV），均購自北京陸橋。沙門氏菌屬熒光PCR檢測試劑盒包括DNA提取液，沙門氏菌反應(yīng)液，Taq酶，沙門氏菌陽性對照，陰性對照，購自深圳市易瑞生物技術(shù)公司；大腸桿菌陽性對照，金黃葡萄球菌陽性對照均購自深圳市易瑞生物技術(shù)公司。

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1.2 方法

1.2.1 前增菌和選擇性增菌

取樣品25g加入225ml緩沖蛋白胨水增菌液，混合均勻，36℃±1℃培養(yǎng)16～20h。移取0.1ml緩沖蛋白胨水增菌液加入10ml氯化鎂-孔雀綠增菌液，36℃±1℃培養(yǎng)24h，增菌液備用。

1.2.2 模板DNA的提取制備

嚴(yán)格按照沙門氏菌屬熒光PCR檢測試劑盒說明操作。

（1）取增菌液1ml加到1.5ml無菌離心管中，12000rpm離心3min，棄去上清液；

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（2）加入50μl DNA提取液，充分混勻后沸水浴5min；

（3）13000rpm離心5min，取上清液進(jìn)行檢測或保存于-20℃以待檢測。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測

沙門氏菌實時熒光PCR反應(yīng)總體系（25μl）包括22.6μl沙門氏菌反應(yīng)液，0.4μl Taq酶，2μl DNA模板。對沙門氏菌進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)見表1。分別以沙門氏菌屬熒光PCR檢測試劑盒中的沙門氏菌陽性對照和陰性對照作為實驗的陽性對照模板和陰性對照。

表1 沙門氏菌熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)

1.2.4 特異性

將沙門氏菌陽性對照、大腸桿菌陽性對照、金黃色葡萄球菌陽性對照、沙門氏菌陰性對照顯著性差異，取出解凍，使用前2000rpm離心20s，向4個PCR反應(yīng)管中分別加入22.6μl反應(yīng)液、0.4μl Taq酶、2μl DNA模板（沙門氏菌陽性對照、大腸桿菌陽性對照、金黃葡萄球菌陽性對照、沙門氏菌陰性對照）；按表1 的參數(shù)分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測，分析該方法的特異性。

1.2.5 飼料中沙門氏菌的檢測

（1）人工污染飼料樣品的檢測

空白飼料10批，各取25g加入225ml緩沖蛋白胨水增菌液，用標(biāo)準(zhǔn)菌株接種，36℃±1℃培養(yǎng)16～20h，取前增菌液進(jìn)行增菌培養(yǎng)、DNA提取、熒光定量PCR檢測，同步用國標(biāo)方法檢測。

（2）空白飼料及自然污染飼料樣品的檢測

空白飼料10批，自然污染飼料3批各取25g進(jìn)行前增菌和增菌培養(yǎng)、DNA提取、熒光定量PCR檢測，同步用國標(biāo)方法檢測。

2 實驗結(jié)果

2.1 特異性檢測結(jié)果

沙門氏菌陽性對照、大腸桿菌陽性對照、金黃葡萄球菌陽性對照、沙門氏菌陰性對照分別進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，試驗結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示僅沙門氏菌陽性對照檢測到熒光信號，其他檢測結(jié)果均為陰性，表明該方法有很強的特異性。

2.2 飼料中沙門氏菌的檢測結(jié)果

（1）陰性添加飼料樣品10批次進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，檢出10批次，同國標(biāo)方法。

（2）空白飼料樣品10批次進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，檢出0批次，同國標(biāo)方法。

（3）自然感染飼料樣品3批次進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，檢出3批次，同國標(biāo)方法。

楊美榮，碩士研究生，從事畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測工作，