張晗， 李硯超， 姜玉剛， 杜立波， 施維， 劉揚

(1. 吉林大學(xué) 分子酶學(xué)工程教育部重點實驗室， 吉林 長春 130012;

2. 中國科學(xué)院化學(xué)研究所 分子動態(tài)與穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)國家重點實驗室， 北京 100190)

抗氧化劑阿魏酸自組裝金納米顆粒的體外抗氧化

張晗1， 李硯超2， 姜玉剛2， 杜立波2， 施維1， 劉揚2

(1. 吉林大學(xué) 分子酶學(xué)工程教育部重點實驗室， 吉林 長春 130012;

2. 中國科學(xué)院化學(xué)研究所 分子動態(tài)與穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)國家重點實驗室， 北京 100190)

摘要：對納米阿魏酸抗氧化劑在巨噬細(xì)胞上的抗氧化保護作用進行檢測,并采用電子順磁-自旋捕獲技術(shù)和光譜法對納米阿魏酸在細(xì)胞水平上清除自由基的能力進行檢測.實驗結(jié)果表明:與抗氧化劑單體相比，納米阿魏酸抗氧化劑可以更為有效地清除由細(xì)胞外界叔丁基過氧化物(t-BuOOH)刺激所產(chǎn)生的活性氧自由基.同時，通過光譜法對細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化物指標(biāo)丙二醛進行檢測，證明納米抗氧化劑可以更為有效地保護經(jīng)受外界刺激的巨噬細(xì)胞.通過自組裝方式可將抗氧化劑納米化有利于提高抗氧化劑的抗氧化水平.

關(guān)鍵詞：電子自旋共振； 抗氧化劑； 自旋捕獲； 納米金； 脂質(zhì)過氧化

氧化應(yīng)激是很多慢性疾病如癌癥、動脈粥樣硬化和神經(jīng)退行性疾病等的重要誘因之一[1-2].抗氧化劑對這些疾病的抵御作用吸引學(xué)者們對其進行了廣泛的研究[3-5]，并且促進了用于治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的新型抗氧化劑的開發(fā).抗氧化劑的體內(nèi)抗氧化活性強弱是其應(yīng)用于疾病治療的決定因素之一[6].因此，目前大部分抗氧化劑研究主要集中于高活性抗氧化劑的設(shè)計和合成[7].然而，盡管已有大量高活性的抗氧化劑出現(xiàn)，但這些抗氧化劑常常伴隨著不可預(yù)期的細(xì)胞毒性等生物相容性問題[8-9].如何在不改變抗氧化劑功能基團的前提下，增強其抗氧化活性并且最大程度提高其生物相容性，對于抗氧化劑的設(shè)計和應(yīng)用具有重要的意義.Du等[10]為這一問題的解決提供了一種可行的方案，即將抗氧化劑自組裝到納米顆粒表面后，在不改變功能基團的前提下，實現(xiàn)抗氧化活性的提高.然而該納米抗氧化劑的生物相容性還不理想，限制了其在生物體內(nèi)的廣泛應(yīng)用.為此，在前期工作的基礎(chǔ)上，設(shè)計并合成了一種聚乙二醇作為配基、阿魏酸功能化的具有高生物相容性的納米抗氧化劑，進一步檢驗這一高生物相容性的納米抗氧化劑是否兼具良好的抗氧化能力，本文對該納米抗氧化劑在細(xì)胞水平上的抗氧化活性進行了測試.

1實驗部分

1.1　實驗材料

試劑.佛波酯(PMA)、L-精氨酸(L-Arg)、N-硝基-L-精氨酸(N-L-Arg)(美國Sigma公司)；氯金酸(沈陽市金科試劑廠)；微量丙二醛 (MDA) 檢測試劑盒(南京碧云天生物科技有限公司)；自由基捕獲探針BMPO和納米阿魏酸為本實驗室合成；其余試劑均購自北京化學(xué)試劑公司.

儀器.Burker ESP 300型順磁共振波譜儀；Hitachi UV 3310型紫外-可見分光光度計.

1.2　電子自旋共振(ESR)捕獲實驗

用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞，待細(xì)胞生長至80%融合度時，消化離心，并用pH值為7.4的PBS緩沖液懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×106cell·mL-1.每孔1 mL細(xì)胞懸液置于12孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別設(shè)置空白對照組、PMA對照組和藥物保護組，加入相同濃度的L-Arg(用PBS配制，0.1 mmol·L-1)孵育30 min，每組設(shè)3個重復(fù).藥物保護組分別加入阿魏酸(或者納米阿魏酸)，混勻并孵育1 min后，加入20 μg·mL-1PMA，隨即進行ESR測試.

1.3　MDA測試實驗

含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基懸浮RAW 264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105cell·mL-1，每孔3 mL細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個重復(fù).待細(xì)胞貼壁生長12 h后，棄去原培養(yǎng)液，分別加入含一定濃度阿魏酸和納米阿魏酸的培養(yǎng)基孵育2 h，之后加入相同濃度的t-BuOOH(用含2%胎牛血清的DMEM維持培養(yǎng)基配制).作用1 h后，裂解細(xì)胞，用微量MDA測定試劑盒進行檢測.

2結(jié)果與討論

2.1　納米抗氧化劑的體外抗氧化保護實驗

PMA刺激巨噬細(xì)胞除產(chǎn)生一氧化氮自由基外，還會產(chǎn)生大量的超氧自由基，而超氧陰離子自由基又極易與NO反應(yīng)，生成過氧亞硝基自由基，從而造成蛋白和DNA的損傷，引起細(xì)胞的凋亡[11-12].因此，PMA刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生超氧自由基可以作為評價細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激的模型.以此模型為例，檢測了抗氧化劑保護的金納米顆粒在細(xì)胞層面的抗氧化保護效果.

目前，細(xì)胞自由基清除效果可用活性氧熒光探針，通過檢測細(xì)胞活性氧熒光強度的變化來判斷[13]，然而金納米顆粒容易造成熒光的淬滅，會對熒光檢測產(chǎn)生干擾[14].因此，采用電子順磁-自旋順磁共振(ESR-spin trapping)法，通過間接檢測自旋捕獲探針捕獲自由基信號強度的變化，實現(xiàn)細(xì)胞層面上的抗氧化保護效果評價.首先，在BMPO[15]存在下，用PMA刺激經(jīng)L-Arg孵育的巨噬細(xì)胞.一方面，刺激細(xì)胞產(chǎn)生NO (約1.8 μmol·L-1)[16]；另一方面，PMA可以直接刺激NADPH酶產(chǎn)生超氧陰離子自由基.NO易與超氧陰離子自由基反應(yīng)形成過氧亞硝酰自由基,而且NO與超氧陰離子自由基的反應(yīng)速率較快(109(mol· s)-1)[17],但使用的BMPO捕捉劑的濃度高達(dá)100 mmol·L-1,其捕獲超氧的速率為102(mol· s)-1[18].同時，考慮到刺激產(chǎn)生的NO與超氧陰離子之間的擴散速率因素，所以通過BMPO捕獲實驗，仍可以得到超氧陰離子自由基加合物的信號.在此條件下,提前加入SOD孵育后,可以明顯地觀察到自由基加合物的信號峰消失,進一步說明BMPO捕獲的是超氧陰離子自由基.

圖1　不同濃度阿魏酸單體和納米阿魏酸　　　　　　　　圖2　不同濃度納米阿魏酸和阿魏酸　　　　　清除細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基　　　　　　　　　清除細(xì)胞內(nèi)自由基(O2·-)的ESR譜圖 　　Fig.1　Free radical-inhibiting activities of different　　　Fig.2　Cellular free radical (O2·-) scavenging 　　concentrations of Ferulic acid and Au@Ferulic acid　　　ESR spectra of Ferulic acid and Au@Ferulic acid

隨著L-Arg濃度(0~2 mmol·L-1)的增加，其超氧自由基加合物的信號也逐漸增加，這表明PMA刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子自由基有可能依賴于NO的產(chǎn)生.前期研究中也證明，隨著L-Arg量的增加，巨噬細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的NO量也逐漸增加[16]，而且NO的產(chǎn)生與ROS的產(chǎn)生有著密切的關(guān)系，其濃度每增加1倍， ROS增加約1.5倍[19].加入L-Arg的抑制劑N-L-Arg，可以觀察到超氧自由基加合物的信號出現(xiàn)了明顯的降低,進一步說明NO的產(chǎn)生與超氧陰離子自由基的產(chǎn)生有著密切的聯(lián)系.綜上所述，這種由PMA刺激巨噬細(xì)胞的模型可以用于細(xì)胞的抗氧化保護檢測.在本實驗中，金納米顆粒的濃度指的是其表面抗氧化劑阿魏酸的總濃度，這樣方便與游離抗氧化劑進行抗氧化活性的比較.分別考察不同濃度納米阿魏酸(Au@Ferulic)和阿魏酸單體對細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧的濃度效應(yīng)，如圖1，2所示.圖1中：c是阿魏酸的濃度；I(ESR)是電子自旋共振波譜的強度.圖2中的ESR條件：微波功率為12.9 mW；信號增益為1×104；調(diào)制幅度為0.1 mT；掃寬為10 mT；時間常數(shù)為0.164 s；掃描時間為84 s.

實驗結(jié)果表明：只需要30 μmol·L-1的納米阿魏酸就可以達(dá)到細(xì)胞內(nèi)所產(chǎn)生活性氧的半數(shù)抑制率；相反，對于單體而言，其清除活性氧的濃度則需要150 μmol·L-1.由此可知，將阿魏酸包裹在金納米顆粒上與阿魏酸單體相比，能夠顯著提高細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基清除速率.

圖3　阿魏酸和納米阿魏酸抑制叔丁基過氧化物刺激細(xì)胞產(chǎn)生MDA實驗Fig.3　Inhibition of intracellular malondialdehyde (MDA) by Ferulic acid and Au@Ferulic acid

2.2　抑制細(xì)胞脂質(zhì)過氧化實驗

為進一步驗證Au@Ferulic在細(xì)胞層面的抗氧化保護效果，利用硫代巴比妥酸(TBA)法對細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)進行了檢測，結(jié)果如圖3所示.由圖3可知:由t-BuOOH處理的巨噬細(xì)胞組，其MDA值增長了4倍；而由阿魏酸單體和納米阿魏酸處理的巨噬細(xì)胞，與t-BuOOH處理組相比，其MDA值分別降低了39.2%和60.5%.由此可知:抗氧化劑特別是納米抗氧化劑，可以明顯地抑制t-BuOOH引起的細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷，起到保護細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的作用.大量實驗表明:金納米顆粒易于通過內(nèi)吞作用進入細(xì)胞內(nèi),達(dá)到在細(xì)胞內(nèi)富集的作用[20];金納米顆粒表面PEG化也有利于提高金納米顆粒在體內(nèi)的循環(huán)時間和藥物的生物相容性, 進而增加藥效[21].因此,納米抗氧劑產(chǎn)生高抗氧化活性的原因可能是抗氧化劑納米化后更易透過細(xì)胞膜進入細(xì)胞內(nèi)，從而快速發(fā)揮抗氧化作用.

3結(jié)束語

以設(shè)計合成的抗氧化劑阿魏酸保護的金納米顆粒為基礎(chǔ)，利用電子順磁-自旋順磁共振法對其在細(xì)胞層面上的抗氧化效果進行了檢測.證明了納米抗氧化劑可以有效地抑制由外界刺激所產(chǎn)生的活性氧對細(xì)胞的損害.結(jié)果表明：納米抗氧化劑具有潛在的生物學(xué)應(yīng)用前景，更為重要的是，通過將抗氧化劑修飾到納米顆粒表面來制備納米抗氧化劑的方式，為新型抗氧化劑的設(shè)計和合成提供了一種全新的策略.

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(責(zé)任編輯： 黃曉楠 英文審校： 劉源崗)

In Vitro Antioxidant Activity Study of Ferulic Acid

Self-Assembled Gold Nanoparticles

ZHANG Han1, LI Yan-chao2, JIANG Yu-gang2,

DU Li-bo2, SHI Wei1, LIU Yang2

(1. Key Laboratory for Molecular Enzymology and Engineering, the Ministry of Education,

Jilin University, Changchun 130012, China;

2. State Key Laboratory for Structural Chemisty of Unstable and Stable Species,

Institute of Chemistry Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190, China)

Abstract：The antioxidant protection effects of ferulic acid nanoantioxidant on macrophage cells were studied and the free radical-inhibiting activities of ferulic acid nanoantioxidant were determined at the cellular level using electron spin resonance-spin trapping and UV-spectrum method. The results illustrates that the nanoantioxidant could eliminate the reactive oxygen species stimulated by t-BuOOH in cells more effectively than that of antioxidants monomers. Meanwhile, the lipid peroxide detection of malondialdehyde by spectrum method also proved that the nanoantioxidant have a high antioxidant activity on t-BuOOH stimulated macrophage cells. Therefore, it could be concluded that the self-assembled nanoantioxidant have a potential for the enhancement of antioxidant activity.

Keywords：electron spin resonance; antioxidant; spin trapping; gold nanoparticles; lipid peroxide

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(31300697, 91227122)

通信作者：杜立波(1980-)，男，副研究員，主要從事自由基與生命科學(xué)的研究.E-mail:dulibo@iccas.ac.cn.

收稿日期：2014-07-02

中圖分類號：O 482.53

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi:10.11830/ISSN.1000-5013.2015.01.0060

文章編號：1000-5013(2015)01-0060-04