吳鑫堯，陳江明，趙義軍，謝 坤，劉付寶，耿小平

3個(gè)VHL綜合征家族的基因檢測(cè)及臨床調(diào)查

吳鑫堯1，陳江明2，趙義軍1，謝 坤1，劉付寶1，耿小平1

摘要目的 明確von Hippel-Lindau綜合征（VHL綜合征）家族基因突變及臨床表現(xiàn)特點(diǎn)，篩查出家族內(nèi)基因突變攜帶者行臨床篩查，綜合家族發(fā)病特點(diǎn)行家族健康指導(dǎo)。方法

通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查，共3例先證者臨床診斷VHL綜合征。抽取先證者及家族自愿者外周血，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）體外擴(kuò)增得到vhl基因片段，通過(guò)測(cè)序得到基因信息；再對(duì)家族內(nèi)具有vhl基因突變的攜帶者進(jìn)行頭顱MRI、腹部B超等對(duì)全身多系統(tǒng)行臨床篩查；綜合家族發(fā)病特點(diǎn)給出家族健康指導(dǎo)。結(jié)果 3例先證者均發(fā)現(xiàn)vhl基因發(fā)生突變，家族1 中5例成員基因陽(yáng)性，突變方式為外顯子1 c.330C＞A；家族2先證者外顯子3488delC；家族3發(fā)現(xiàn)7例基因陽(yáng)性者，突變方式為外顯子1 c.233G＞A。其中，家族成員1III3、3III1、3III4、3IV3確定為基因突變攜帶者，臨床檢查顯示其中3例成員已發(fā)病，1III3表現(xiàn)為雙腎多發(fā)囊腫，胰腺多發(fā)囊腫；3III1表現(xiàn)為胰腺多發(fā)囊腫；3III4表現(xiàn)為視網(wǎng)膜血管母細(xì)胞瘤、胰腺多發(fā)囊腫，視網(wǎng)膜血管母細(xì)胞瘤接受激光治療。3IV3由于年齡較小，臨床檢查未見(jiàn)明顯異常。所有基因攜帶者接受規(guī)范化隨訪。結(jié)論 基因檢測(cè)可早期確診VHL綜合征，臨床上對(duì)vhl基因突變患者需進(jìn)行嚴(yán)密隨訪，從而提高患者治療效果、延長(zhǎng)生存期或改善生活質(zhì)量。

關(guān)鍵詞VHL綜合征；vhl基因；基因檢測(cè)

2015-02-13接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院器官移植中心，合肥230022

2安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科，合肥 230601

von Hippel-Lindau綜合征（VHL綜合征）是一種常染色體顯性基因遺傳性疾病，是染色體3P25 （OMIM 193300）長(zhǎng)約10 bp的VHL腫瘤抑制基因突變所致。發(fā)生率約1／36 000，60歲之前，基因外顯率達(dá)95%［1］。臨床上常表現(xiàn)為視網(wǎng)膜及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血管母細(xì)胞瘤、腎透明細(xì)胞癌、嗜鉻細(xì)胞瘤和胰腺腫瘤。盡管目前對(duì)該病分子生物學(xué)的認(rèn)識(shí)以及手術(shù)時(shí)機(jī)的選擇有所進(jìn)展，但VHL綜合征患者的平均生存年齡僅49歲［2］。該研究通過(guò)對(duì)3例臨床診斷VHL綜合征的患者及其家族內(nèi)27例自愿者行vhl基因檢測(cè)，報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1 病例資料 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011 年1月～2013年12月有3例患者臨床診斷為VHL綜合征，3個(gè)家族共31例成員均自愿加入本項(xiàng)研究，簽署知情同意書(shū)，抽取每個(gè)家族成員外周血5 ml，于-80℃冰箱保存，并收集臨床資料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 用血液基因組DNA提取試劑盒Flexigene DNA kit（Qiagen，51204）提取外周血DNA，并以電泳檢測(cè)提取DNA純度，檢測(cè)條件為150 V、100 mA電脈20 min，見(jiàn)圖1。

1.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reactions，PCR） 用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物涵蓋VHL基因全部3個(gè)外顯子編碼區(qū)域，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，見(jiàn)表1。PCR將基因組DNA（100～200 ng）擴(kuò)增，25 μl PCR反應(yīng)體系包括：15.5 μl蒸餾水，5 μl 5×buffer緩沖液，1 μl脫氧核苷三磷酸（5 mmol／L），1 μl DNA模板，0.5 μl DNA聚合酶，40 mmol／L的上下游引物各1 μl。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件：外顯子1 95℃預(yù)變性10 min，95℃30 s，62℃30 s，72℃20 s，共35個(gè)循環(huán)，最終72℃下延伸10 min。外顯子2和外顯子3在60℃下行PCR擴(kuò)增。1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA電泳20 min后使用紫外凝膠成像儀進(jìn)行PCR結(jié)果檢測(cè)。

1.2.3 PCR反應(yīng)純化及測(cè)序 PCR產(chǎn)物經(jīng)AxyPrep-96 Kit純化后送生工測(cè)序。

1.2.4 測(cè)序結(jié)果分析 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）中找到VHL基因，其包含3個(gè)外顯子共642個(gè)密碼子，編碼214個(gè)氨基酸（包含末端不翻譯氨基酸的3個(gè)終止密碼子），Multalin方法對(duì)測(cè)得DNA序列比對(duì)（http：／／multalin.toulouse.inra.fr／multalin／）。測(cè)得序列在http：／／web.expasy.org／translate／中將可能表達(dá)氨基酸翻譯，并與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。

表1　vhl基因外顯子片段大小和用于PCR擴(kuò)增及測(cè)序的引物信息

1.3 臨床檢查方法 行VHL家族調(diào)查，并對(duì)家族內(nèi)基因突變攜帶者行頭顱MRI、B超（肝、膽、胰、脾、腎、腎上腺及盆腔）、眼底、血尿常規(guī)及尿兒茶酚胺檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1 基因檢測(cè)結(jié)果 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示均獲得預(yù)期大小的擴(kuò)增片段。3個(gè)家族31例健在成員均自愿接受基因分析，并繪制樹(shù)狀圖。結(jié)果包括先證者在內(nèi)，家族1中5例成員vhl基因陽(yáng)性，家族2中1例，家族3中7例。4例（1Ⅲ3、3Ⅲ1、3Ⅲ4、3Ⅳ3）家族成員確定為基因突變攜帶者，3個(gè)家族基因突變方式分別為：家族1外顯子1第330位堿基A替換為堿基C，導(dǎo)致vhl基因編碼的第110個(gè)氨基酸組胺酸變?yōu)楦彼?。家?外顯子3 第488位堿基C缺失，結(jié)果致vhl編碼的氨基酸162位以后全部紊亂。家族3外顯子1第233位堿基A轉(zhuǎn)換為堿基G，導(dǎo)致vhl基因編碼的第98個(gè)氨基酸天冬酰胺酸變?yōu)榻z氨酸，見(jiàn)表2。

表2　3個(gè)家族基因突變位點(diǎn)、家系基因篩查結(jié)果以及VHL綜合征發(fā)病類型

2.2 臨床檢查

2.2.1 家族調(diào)查 家族1：先證者1Ⅱ1，男，48歲，

1991年因進(jìn)行性的頭痛入安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行“小腦血管母細(xì)胞瘤切除”，術(shù)后恢復(fù)良好，至今無(wú)復(fù)發(fā)?；颊?003年出現(xiàn)肉眼血尿，行“左腎透明細(xì)胞癌剜除術(shù)”，術(shù)后入安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科二病區(qū)規(guī)范隨訪，2007年行“右腎透明細(xì)胞癌剜除術(shù)”，2012年行“左腰部轉(zhuǎn)移瘤切除＋左側(cè)腎臟腫瘤射頻消融”，術(shù)后不久發(fā)現(xiàn)左側(cè)腰部腫塊復(fù)合，呈進(jìn)行性增大，考慮腎透明細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移，2014年1月行“左腰部腫瘤活檢＋左腎腫瘤射頻消融術(shù)”，術(shù)后鏡檢于腰部脂肪組織見(jiàn)透明細(xì)胞腫瘤結(jié)節(jié)?；颊?I1因多年頭痛，48歲去世?；颊? II3，47歲，10年前因頭暈發(fā)現(xiàn)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，雙腎多發(fā)囊腫，一直保守治療。2012年因雙腎囊腫于南京軍區(qū)總醫(yī)院行雙腎囊腫開(kāi)窗引流術(shù)，治療效果不佳，囊腫無(wú)法完全根治，在患者診治期間，其女兒（1III6），23歲，醫(yī)生建議后體檢發(fā)現(xiàn)多囊肝，雙腎多發(fā)囊腫，至今尚無(wú)明顯臨床癥狀。先證者兒子（1III1），25歲，2年前因頭暈，行走不穩(wěn)，入安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院診斷小腦血管母細(xì)胞瘤，手術(shù)切除腫瘤，至今無(wú)復(fù)發(fā)。

家族2：先證者2II2，男，45歲，2013年12月因出現(xiàn)肉眼血尿半月余，安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院診斷多發(fā)腎臟占位、肺部轉(zhuǎn)移可能、雙側(cè)腎上腺占位，失去治療時(shí)機(jī)，現(xiàn)腫瘤前列腺、骨多發(fā)轉(zhuǎn)移，于合肥市第五人民醫(yī)院保守對(duì)癥治療，一般狀況極差，見(jiàn)圖3A?；颊? I2，23歲體檢發(fā)現(xiàn)腎上腺占位、多發(fā)胰腺囊腫、多囊腎，并于上海市中山醫(yī)院行腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤切除術(shù)，胰腺囊腫未予處理。49歲出現(xiàn)血尿，診斷腎癌多發(fā)轉(zhuǎn)移，50歲去世。患者2II1，為先證者孿生哥哥，2011年因頭暈，行頭顱MRI見(jiàn)左側(cè)小腦半球囊性病變，于北京天壇醫(yī)院行小腦腫瘤切除術(shù)，術(shù)后證明為血管母細(xì)胞瘤。2013年因腎透明細(xì)胞癌多發(fā)轉(zhuǎn)移去世。

家族3：先證者3III2，女，27歲，2007年因行走不穩(wěn)診斷小腦腫瘤，見(jiàn)圖3B。手術(shù)切除后2010年、2013年兩次復(fù)發(fā)，再次手術(shù)治療。先證者左眼視物不清7年，失明1年，一直未予診治，近期出現(xiàn)左眼脹痛，發(fā)作頻繁，經(jīng)指導(dǎo)后檢查發(fā)現(xiàn)左眼眼底反光異常，正常紅光反射消失，網(wǎng)膜可見(jiàn)不規(guī)則滲出病灶，靜脈淤曲明顯，并見(jiàn)自視乳頭顳側(cè)生成粗大扭曲滋養(yǎng)血管，并見(jiàn)后極部增殖膜，遠(yuǎn)端見(jiàn)瘤體，見(jiàn)圖3C。先證者父輩發(fā)病3例，患者3II1 58歲，2014年2月因肉眼血尿1 d于淮南市人民醫(yī)院就診，診斷雙腎多發(fā)腎癌晚期，失去治療時(shí)機(jī)，納入隨訪。患者3II2，1990年因頭暈行小腦腫瘤切除術(shù)，1993年腫瘤復(fù)發(fā)，再次手術(shù)切除，因術(shù)后出血死亡?；颊?II5，15年前因頭痛、頭暈急性發(fā)作，入淮南市礦三院，診斷雙腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤、小腦腫瘤，治療期間顱內(nèi)出血死亡。家族成員3III1平日偶感腹脹，癥狀可自行緩解，未予診治。

2.2.2 臨床檢查 對(duì)4例（1III3、3III1、3III4、3IV3）基因突變攜帶者進(jìn)行頭顱MRI（3IV3年齡小于15歲未行MRI檢查）、B超（肝、膽、胰、脾、腎、腎上腺及盆腔）、眼底、血尿常規(guī)及尿兒茶酚胺檢測(cè)，其中3例（1III3、3III1、3III4）攜帶者檢查發(fā)現(xiàn)異常。1III3，21歲，腹部CT提示多發(fā)胰腺囊腫，見(jiàn)圖3D。3III1，33歲，平日偶感腹脹，未予重視，此次基因檢查突變陽(yáng)性后行腹部CT發(fā)現(xiàn)胰腺及雙腎多發(fā)囊腫，見(jiàn)圖3E。3III4，22歲，基因檢測(cè)陽(yáng)性情況下眼底檢查發(fā)現(xiàn)雙側(cè)眼底視網(wǎng)膜血管母細(xì)胞瘤，造影見(jiàn)瘤體及粗大扭曲的滋養(yǎng)血管，見(jiàn)圖3F。

3個(gè)家族共14例發(fā)病患者，男女發(fā)病比例4∶3，其中3例患者經(jīng)基因篩查后臨床檢查證實(shí)已發(fā)病。14例發(fā)病患者首次出現(xiàn)癥狀的年齡為19～58（30.2±10.7）歲。病變部位包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管網(wǎng)狀細(xì)胞瘤6例、腎透明細(xì)胞癌5例、視網(wǎng)膜血管母細(xì)胞瘤2例、胰腺多發(fā)囊腫6例、腎臟多發(fā)囊腫8例，嗜鉻細(xì)胞瘤5例。中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤患者除家系3中3II5未手術(shù)即死亡外，余患者共7次小腦腫瘤手術(shù)，腫瘤平均復(fù)發(fā)時(shí)間5.8年。5例腎透明細(xì)胞癌的患者，僅1例患者7年內(nèi)連續(xù)行4次腎臟手術(shù)，腫瘤平均復(fù)發(fā)時(shí)間1.75年，余4例均因發(fā)現(xiàn)晚而延誤治療。3個(gè)家族共5例患者死亡，死亡率35.7%。2例死于中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤，3例死于腎癌，平均死亡年齡33歲。

3　討論

VHL綜合征是常染色體顯性遺傳病，因vhl腫瘤抑癌基因突變所致，遺傳率50%，該抑癌基因包含3個(gè)外顯子，共轉(zhuǎn)錄213個(gè)氨基酸。外顯子2的表達(dá)（亞型I）或不表達(dá)（亞型II）導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄為2種不同的剪接RNA。亞型I有2種轉(zhuǎn)錄結(jié)果：pVHL30和pVHL19，兩者在人體組織中均廣泛表達(dá)并扮演著控制轉(zhuǎn)錄伸展率的角色，二者統(tǒng)稱為pVHL。低氧誘導(dǎo)因子HIF1和HIF2是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，掌控基因轉(zhuǎn)錄激活促進(jìn)細(xì)胞在低氧環(huán)境下適應(yīng)及生長(zhǎng)。pVHL可與elongin B、elongin C、cullin-2及Rbx1等其他蛋白結(jié)合形成復(fù)合物VCB-Cu12，

繼而作用于HIF1和HIF2ɑ亞基來(lái)調(diào)節(jié)泛素介導(dǎo)的蛋白降解。低氧的環(huán)境或pVHL喪失及活性下降時(shí)，HIF1和HIF2穩(wěn)定并成為低氧反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。這種低氧反應(yīng)影響了葡萄糖的攝取和代謝，使血管生成，形成細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞增殖，從而涉及VHL綜合征相關(guān)腫瘤的產(chǎn)生［3-6］。

表3　3個(gè)家族15例基因檢測(cè)陽(yáng)性者臨床發(fā)病特點(diǎn)

張進(jìn)等［7］完成了中國(guó)9個(gè)VHL家族的基因突變研究，其中錯(cuò)義突變最多（7／9），突變的位置主要集中在第1外顯子的后1／3。有學(xué)者對(duì)中國(guó)各地共70個(gè)家族基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變80%，大片段缺失17.3%，18個(gè)突變位于外顯子1 （26個(gè)家族），7個(gè)突變位于外顯子2（7個(gè)家族），11個(gè)突變位于外顯子3（18個(gè)家族），1個(gè)突變位于外顯子2，1個(gè)突變位于3’-UTR?？梢?jiàn)外顯子1和外顯子3為突變高發(fā)區(qū)域（51%）［8］。本組研究顯示第1、3家族均為點(diǎn)突變，家族突變位點(diǎn)均位于外顯子1后2／3，另1個(gè)家族外顯子3堿基C缺失。

臨床上VHL綜合征多采用Maher et al［2］提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)：①有家族史，患中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤或視網(wǎng)膜血管母細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞癌、嗜鉻細(xì)胞瘤以及內(nèi)囊淋巴瘤其中任一疾病，建立診斷。②無(wú)家族史，≥2種中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤，或者有1種中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤合并一處內(nèi)臟病變建立診斷。本組3個(gè)先證者有明確家族史，已臨床診斷VHL綜合征。家族成員1Ⅲ3、3Ⅲ1、3Ⅲ4、3Ⅳ3，基因篩查陽(yáng)性，臨床檢查表明3例家族成員已發(fā)病。前2例患者表現(xiàn)為胰腺和腎臟囊腫，可能為胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤及腎透明細(xì)胞癌的癌前病變，予之隨訪觀察?；颊?Ⅲ4表現(xiàn)為視網(wǎng)膜血管母細(xì)胞瘤，為防止病灶逐漸擴(kuò)大及相關(guān)并發(fā)癥影響視力，2014年7月在臨床指導(dǎo)下行激光治療。

研究［2］顯示，vhl基因型與臨床表現(xiàn)型存在相關(guān)性，基因錯(cuò)義突變所編碼的蛋白常表現(xiàn)為嗜鉻細(xì)胞瘤。本組家族1因外顯子1第330位堿基A替換為

堿基C，發(fā)生錯(cuò)義突變，家族3因外顯子1堿基A轉(zhuǎn)換為堿基G，導(dǎo)致錯(cuò)義突變。但是同一家族之間可見(jiàn)發(fā)病的時(shí)間與病變累及部位不盡相同。如家族2，先證者與其孿生哥哥，都有腎臟病變及嗜鉻細(xì)胞瘤，但先證者未出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤。

臨床調(diào)查表明VHL綜合征具有發(fā)病年齡輕、多呈隱匿發(fā)病、腫瘤易復(fù)發(fā)、死亡率高、患者生存時(shí)間短的特點(diǎn)。本組14例發(fā)病患者，首次出現(xiàn)癥狀的平均年齡為30.2歲，5例患者出現(xiàn)癥狀后無(wú)法手術(shù)治療。5例中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤患者共7次小腦腫瘤手術(shù)，腫瘤平均復(fù)發(fā)時(shí)間5.8年。1例腎透明細(xì)胞癌患者7年內(nèi)連續(xù)行4次腎臟手術(shù)，腫瘤平均復(fù)發(fā)時(shí)間1.75年。5例患者死亡，死亡率35.7%，平均死亡年齡33歲。

VHL綜合征表現(xiàn)為全身多系統(tǒng)病變，病變部分早期隱匿，臨床上難以早期診斷，導(dǎo)致患者治療效果不佳，死亡率高。該疾病在患者家族引起恐慌，基因檢測(cè)可明確診斷并篩選出基因突變攜帶者，消除家族成員恐慌情緒。對(duì)基因突變陽(yáng)性成員進(jìn)行臨床隨診，可以把握患者治療時(shí)機(jī)、提高治療效果、延長(zhǎng)生存時(shí)間及提高生活質(zhì)量。

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Mutation analysis and clinical investigation of three Chinese families with VHL disease

Wu Xinyao1，Chen Jiangming2，Zhao Yijun1，et al
（1Organ Transplantation Center，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of General Surgery，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

AbstractObjective To detect the genetic mutations of vhl gene of three families who were diagnosed in clinical，and screen the carriers for clinical guiding treatment.Methods The vhl gene was screened for mutation using a direct DNA sequencing analysis for 31 members from three families.The genetic mutations carriers were required to undergo further clinical examination，surveillance and treatment.Results The genetic testing results were based on positive three probands.5 members of family 1 had positive genes，1 member in family 2，7 members in family 3.The position of three von Hippel-Lindau syndrome（VHL）families genes mutations sites was separately on c.330C＞A in exon1，488delC in exon3 and c.233G＞A in exon1.In DNA sequencing analysis，we found four potential carriers（1Ⅲ3，3Ⅲ1，3Ⅲ4，3Ⅳ3），and combined with clinical examination，three（1Ⅲ3，3Ⅲ1，3Ⅳ3）of them had disease.1Ⅲ3 was diagnosed with multi-cysts on kidney and pancreas，3Ⅲ1 was diagnosed with pancreatic multi-cysts.3Ⅲ4 was diagnosed with retinal hemangioblastoma.We had guided the member 3IV3 for eye surgery.3IV3 was not found with abnormal symptoms because of her young age.And all of the gene carriers should have the follow-up visit.Conclusion Genetic testing can diagnose VHL syndrome early.To improve patients＇treatment，prolong survival and improve the quality of life，the patients with vhl gene mutations need follow-up closely.

Key wordsvon Hippel-Lindau syndrome；vhl gene；gene detection

作者簡(jiǎn)介：吳鑫堯，男，碩士研究生；劉付寶，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：liufubao88＠163.com

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1308085MH133）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）05-0635-05

中圖分類號(hào)R 394.3