郭德玉，孫芳玲，魏仁平，劉婷婷，程華，艾厚喜，田欣，祝自新，鄭文榮，王宇峰，王文,3

莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠血管內(nèi)皮生長因子和成纖維生長因子-2表達的影響

郭德玉1，孫芳玲1，魏仁平2，劉婷婷1，程華1，艾厚喜1，田欣1，祝自新1，鄭文榮1，王宇峰1，王文1,3

[摘要]目的觀察莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和成纖維生長因子-2 (FGF-2)表達的影響。方法25只成年雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、莫諾苷小劑量組(30 mg/kg)、莫諾苷中劑量組(90 mg/ kg)和莫諾苷大劑量組(270mg/kg)。采用改良線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO) 30min再灌注模型。再灌注7d后利用蛋白免疫印跡法檢測梗死側(cè)皮層VEGF和FGF-2蛋白表達。結(jié)果與假手術(shù)組相比，缺血再灌注7 d后，各組梗死側(cè)大腦皮層VEGF、FGF-2的表達均有增加(P<0.05)；莫諾苷小、中、大劑量組VEGF表達進一步增加(P<0.05)；莫諾苷大劑量組FGF-2的表達進一步顯著增加(P<0.001)。結(jié)論莫諾苷可以促進局灶性腦缺血再灌注后VEGF和FGF-2的表達，可能有助于促進缺血性腦損傷后的血管新生。

[關(guān)鍵詞]腦缺血再灌注；莫諾苷；血管新生；血管內(nèi)皮生長因子；成纖維生長因子-2；大鼠

[本文著錄格式]郭德玉，孫芳玲，魏仁平，等.莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠血管內(nèi)皮生長因子和成纖維生長因子-2表達的影響[J].中國康復理論與實踐, 2015, 21(11): 1241-1244.

CITED AS: Guo DY, Sun FL, Wei RP, et al. Effectsof morronisideon expression of vascular endothelial growth factor and fibroblast growthfactor-2inratsafter focal cerebral ischemia-reperfusion[J]. Zhongguo Kangfu LilunYu Shijian, 2015, 21(11): 1241-1244.

缺血性腦卒中有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點，嚴重危害著人類生命健康，一直以來是臨床研究的焦點。動物實驗證實，缺血性腦卒中后，神經(jīng)血管的微環(huán)境改變可以誘導血管新生[1]。血管新生對腦卒中后期康復非常重要：新生的血管可為神經(jīng)發(fā)生提供神經(jīng)營養(yǎng)因子，并為新生的神經(jīng)細胞遷移到缺血周邊區(qū)域提供依附的支架，是梗死周邊區(qū)域腦組織抗損傷和神經(jīng)元修復的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[2-3]。但腦損傷誘發(fā)的血管新生過程短暫而微弱，不足以恢復神經(jīng)血管單元穩(wěn)態(tài)。

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growthfactor, VEGF)是血管新生過程中最重要的絲裂原，參與微血管滲透性，以及內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和存活[4-5]。有研究表明，缺血后VEGF的表達上調(diào)可以對神經(jīng)元起到保護作用，并且誘導血管新生[6]；VEGF誘導的血管新生可以促進神經(jīng)干細胞的增殖和分化[7]。

成纖維生長因子-2 (fibroblast growth factor-2, FGF-2)是較早發(fā)現(xiàn)的促血管新生因子之一，它能通過誘導VEGF合成，與VEGF和其他信號通路協(xié)同，促進血管新生[8]。通過外源性藥物或其他手段提高缺血后VEGF與FGF-2的表達，將能更好地促進缺血性腦損傷的神經(jīng)康復。

中藥山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(Cornusofficinalis Sieb. et Zucc.)的干燥成熟果實。本實驗室對其有效成分山茱萸環(huán)烯醚萜苷進行進一步分離，得到單體化合物莫諾苷。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，莫諾苷能減小局灶性腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積，增強皮層抗氧化、抗炎和抗凋亡能力，并促進內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖，改善神經(jīng)功能[9-13]。我們初步研究發(fā)現(xiàn)，莫諾苷能夠促進大鼠腦缺血后梗死灶周邊皮層區(qū)域血管密度增加。本研究探討莫諾苷對VEGF和FGF-2表達的影響，為莫諾苷促進血管新生的作用機制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物

SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠25只，體質(zhì)量260～280 g，購自斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司，合格證號：SCKK(京)2011-0004。飼養(yǎng)于宣武醫(yī)院實驗動物室(許可證號：SYXK(京)2010-0013)，環(huán)境溫度(24±2)℃，相對濕度(55±5)%，術(shù)前12 h禁食，不禁水。

1.2藥物

莫諾苷由宣武醫(yī)院藥物研究室自行從山茱萸中提取制備，高效液相色譜分析純度98.5%。使用前用蒸餾水溶解成所需濃度的藥液。

1.3試劑和儀器

兔源性VEGF多克隆抗體、鼠源性FGF-2單克隆抗體：美國SANTA CRUZ公司。鼠源性β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠二抗：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。RIPA裂解液：碧云天生物技術(shù)研究所。BCA法蛋白定量試劑盒：北京普利萊基因技術(shù)有限公司。ECL Western Blotting Kit：美國THERMO-PIERCE公司。

JY92-Ⅱ型超聲波細胞破碎粉碎機：寧波市新芝科技研究所。Microfuge22R臺式微量冷凍離心機：美國BECKMAN COULTER公司。Powerpac Basic電泳儀：美國BIO-RAD公司。ImageStation 4000R高分辨率多模式分子成像系統(tǒng)：美國CARESTREAM HEALTH公司。Multiskan Spectrum全波長酶標儀：美國THERMOFISHER公司。

1.4方法

1.4.1模型制備

參照Longa線栓法[14]制備大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型。大鼠10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉后大鼠仰臥置于手術(shù)操作臺上，安爾碘頸部周圍消毒。頸正中切口2 cm，分離肌肉及筋膜，注意避開甲狀腺。暴露氣管右側(cè)及胸骨舌骨肌和胸鎖乳突肌之間的三角區(qū)，鈍性分離出右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈。結(jié)扎頸外動脈分叉處及頸總動脈近心端，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，在頸總動脈用眼科剪剪一個斜行細小切口，小心插入栓線，緩慢輕推栓線進入頸內(nèi)動脈，直到產(chǎn)生阻擋感，說明栓線已經(jīng)經(jīng)過頸總動脈分叉處，通過頸內(nèi)動脈進入大腦中動脈，到達大腦前動脈起始部。將栓線與頸內(nèi)動脈一并結(jié)扎，松開動脈夾，記錄開始時間?？p合肌肉，創(chuàng)口處涂少量青霉素，以預防傷口感染。30min后，用眼科鑷緩慢拔出栓線。

假手術(shù)組進行相同手術(shù)操作，但不插栓線。

術(shù)后注意保溫，大鼠未醒前置于溫控毯上。

1.4.2分組與給藥

大鼠清醒后，參照Longa5分法行神經(jīng)功能損傷評分[15]：1分，提鼠尾離開地面約33 cm，不能充分伸展對側(cè)前肢；2分，提鼠尾離開地面約33 cm，對側(cè)前肢屈曲；3分，將大鼠置于地面，向?qū)?cè)行走；4分，將大鼠置于地面，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，呈追尾狀；5分，損傷嚴重，對側(cè)肢體癱瘓。剔除1分和5分的大鼠。符合要求的動物按評分高低，分為假手術(shù)組，模型組，莫諾苷小、中、大劑量組，每組3只。

莫諾苷溶于蒸餾水，造模后3 h按30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d。假手術(shù)組和模型組給予等體積蒸餾水。

1.4.3 Westernblotting

造模后7 d，大鼠10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速剝離大腦并將腦膜剝?nèi)?，取出患?cè)皮層包入錫箔紙中，液氮凍存片刻，-80℃保存。

取出患側(cè)皮層于5 ml EP管中稱重，加入預冷的裂解液7 μl/mg、PMSF 10 μl/ml裂解液，冰上充分超聲粉碎。4℃靜止30 min，4℃12000 r/min離心30 min，取上清。BCA法定量蛋白濃度，加入用裂解液，調(diào)節(jié)各組總蛋白濃度一致。總蛋白加入5×上樣緩沖液1∶4稀釋，95℃變性10min。

VEGF和FGF-2采用10% SDS-PAGE分離膠，濃縮膠用5%SDS-PAGE。濃縮膠電壓60 V，40min，分離膠電壓90 V，90 min，電泳分離蛋白。0.45 μm NC膜轉(zhuǎn)膜；條帶在5%脫脂奶粉中封閉2 h；分別加兔多克隆VEGF抗體(1∶1000)、小鼠單克隆FGF-2抗體(1 ∶1000)和小鼠單克隆β-actin抗體(1∶1000)，4℃冰箱孵育過夜。TBST緩沖液洗滌3次，每次10min。加相應(yīng)辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min；ECL顯色1 min，濾去顯色液，凝膠成像儀拍片。Quanity One軟件分析蛋白條帶光密度值。

1.5統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行處理，結(jié)果以(xˉ±s)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1VEGF

模型組VEGF蛋白表達水平比假手術(shù)組升高(P< 0.05)；與模型組相比，莫諾苷小、中、大劑量組VEGF蛋白表達水平均升高(P<0.05)。見表1。

2.2FGF-2

模型組FGF-2蛋白表達水平比假手術(shù)組升高(P< 0.05)；與模型組相比，莫諾苷大劑量組FGF-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.001)。見表2。

表1　各組造模后患側(cè)皮層VEGF的表達

表2　各組造模后患側(cè)皮層VEGF的表達

3　討論

大腦缺血后的恢復是一個復雜、動態(tài)的過程，包括早期損傷后應(yīng)激信號以及內(nèi)源性自我修復系統(tǒng)的激活。對缺血后血管新生分子機制的研究表明，在血管新生過程中最重要的階段是內(nèi)皮祖細胞激活，這對血管穩(wěn)態(tài)和修復至關(guān)重要[14-15]。

血管新生過程受血管生成因子VEGF/VEGFR系統(tǒng)調(diào)控。缺血后3 h，梗死側(cè)大腦VEGF表達開始升高，并且可持續(xù)7 d。VEGF可以通過上調(diào)Notch的配體Delta-like4(Dll4)，促進內(nèi)皮細胞芽生過程中的頂端細胞增殖；給予外源性VEGF可以促進缺血半暗帶的血管新生，并促進神經(jīng)功能恢復[16-18]。

FGF-2是潛在的促血管生成因子，可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的遷移、增殖和代謝活動。Guo等證明，F(xiàn)GF-2能顯著促進內(nèi)皮細胞增殖、血管芽生；刺激纖維蛋白酶和內(nèi)皮細胞膠原酶降解基底膜，使新生血管更容易向缺血區(qū)長入；誘導新生毛細血管管腔形成，進而增加卒中后缺血區(qū)域的腦血流量[19]。

本研究顯示，缺血性腦損傷能刺激促血管生成因子的生成，激活血管新生的分子機制，誘發(fā)血管新生；給予莫諾苷治療后，VEGF和FGF-2蛋白表達水平進一步增加，表明莫諾苷很可能通過調(diào)節(jié)VEGF和FGF-2的表達，改善腦內(nèi)神經(jīng)血管微環(huán)境，促進缺血性腦損傷后血管新生的修復過程。

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作者單位：1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院實驗動物室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京市100053；2.河北北方學院，河北張家口市075000；3.北京市腦重大疾病研究院，北京市100069。作者簡介：郭德玉(1960- )，男，漢族，北京市人，副主任技師，主要研究方向：人類疾病動物模型的制作。通訊作者：王文，男，博士，教授，研究員，主要研究方向：神經(jīng)藥理、中藥藥理。E-mail: lzwwang@163.com。

Effectsof Morronisideon Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Fibroblast Growth Factor-2 in Ratsafter Focal Cerebral Ischemia-reperfusion

GUO De-yu1, SUN Fang-ling1, WEI Ren-ping2, LIU Ting-ting1, CHENG hua1, AI Hou-xi1, TIAN Xin1, ZHU Zi-xin1, ZHENGWen-rong1, WANGYu-feng1, WANGWen1,3
1. Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing 100053, China; 2. Hebei North University, Zhangjiakou, Hebei 075000, China; 3. Beijing Institutefor Brain Disorders, Beijing100069, China

Abstract:Objective To investigate the effects of morroniside on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and fibroblast growth factor-2 (FGF-2) in rat cortex after focal cerebral ischemia-reperfusion. Methods30 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group, model group, morroniside-low group (30 mg/kg), morroniside-middle group (90 mg/kg) and morroniside-high group (270 mg/kg). Middle cerebral arteries of rats were occluded for 30 minutes with Longa's method and re-perfused. The expression of VEGF and FGF-2 in theischemic ipsilateral cortex wasdetected with Western blotting 7 daysafter reperfusion. ResultsTheexpression of both VEGF and FGF-2 increased in the ischemic ipsilateral cortexin in all the ischemic groups compared with the sham group (P<0.05). Theexpression of VEGF further increased in adose-dependent manner in all themorronisidegroupscompared with that of model group (P<0.05), and the expression of FGF-2 increased in the morroniside-high group (P<0.001). Conclusion Morroniside could increase theexpressionof VEGFand FGF-2after ischemia-reperfusion, whichmight promoteangiogenesis.

Key words:cerebral ischemia-reperfusion; morroniside; angiogenesis; vascular endothelial growth factor; fibroblast growth factor-2; rats

(收稿日期：2015-07-13修回日期：2015-09-06)

基金項目：1.“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(No.2012ZX09102201-106)；2.國家自然科學基金項目(No. 81373994; No.81173575)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.11.001

[中圖分類號]R743.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2015)11-1241-04