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缺氧與腫瘤惡性演進(jìn)的關(guān)系及其機(jī)制探討*

2015-03-05 05:53楊慶強(qiáng)唐春燕
重慶醫(yī)學(xué) 2015年16期
關(guān)鍵詞:細(xì)胞核明膠條帶

楊慶強(qiáng),唐春燕

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科,四川瀘州646000;2.瀘州醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院衛(wèi)校,四川瀘州646000)

絕大多數(shù)實(shí)體腫瘤中存在低氧微環(huán)境,氧分壓為0~20 mm Hg,而正常組織則在40 mm Hg以上[1]。低氧微環(huán)境與腫瘤的惡性進(jìn)展、放化療的耐受性及預(yù)后不良密切相關(guān)[2-3]。本實(shí)驗(yàn)觀察低氧下HT-29 細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶2/9(MMP-2/9)活性,并檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的蛋白表達(dá),初步探討低氧與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)系及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供;細(xì)胞核蛋白/細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(百泰克公司);兔抗人NF-κB多克隆抗體(Neomarkers公司);辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司);明膠(Sigma公司);RPMI-1640(Hyclone公司);胎牛血清(杭州四季青公司);4.8%O2、90.2% N2和5%CO2三元混合氣體;低氧培養(yǎng)裝置。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HT-29細(xì)胞。分為對(duì)照組和低氧組。對(duì)照組置于普通常氧下的37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);低氧條件參照文獻(xiàn)[1,4],在前期的研究中發(fā)現(xiàn)持續(xù)灌注低流量(4.8%)的O2,培養(yǎng)液O2壓力將恒定于20mm Hg(參照體內(nèi)腫瘤的氧分壓水平)。將低氧培養(yǎng)裝置置于37 ℃恒溫水浴箱內(nèi),真空泵抽盡前者的空氣,從入氣口灌入含4.8% O2、90.2% N2和5% CO2三元混合氣體(3.0L/min),并打開(kāi)出氣口閥門,20min后減少混合氣流量至0.1L/min,以維持低氧狀態(tài),低氧組HT-29細(xì)胞置于該低氧裝置內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 提取細(xì)胞核蛋白及Western blot分析 分別低氧培養(yǎng)0、6、12、24和48h,對(duì)照組常氧下培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間,各時(shí)相點(diǎn)設(shè)8個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。收集細(xì)胞后用PBS液漂洗。依照細(xì)胞核蛋白/細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞核蛋白,加入添加了苯甲基磺酰氟的CER A,漩渦震蕩15s,冰浴15 min,再加入CER B,漩渦震蕩5s,冰浴1min,4 ℃12 000×g離心5min,棄上清。對(duì)于沉淀,加入添加了苯甲基磺酰氟的NER 并將其分散,冰浴40min,期間每5分鐘劇烈渦流15s,再4 ℃12 000×g離心10min,該上清即為細(xì)胞核蛋白,吸取后用于檢測(cè)NF-κB。蛋白樣品加入上樣緩沖液煮沸5min,離心、上樣(20μg/道),行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,再轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶粉封閉1h后,加入1∶200稀釋的兔抗人NF-κB/p65多克隆抗體,4 ℃過(guò)夜,用β-actin作內(nèi)參照。TBST 洗膜,再加入1∶1 000稀釋的辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG,37 ℃1h,洗膜,滴加ECL發(fā)光試劑,Bio-Rad圖像處理系統(tǒng)Hisensitivity模式監(jiān)測(cè)其曝光顯影,并測(cè)定蛋白條帶相對(duì)灰度,相對(duì)灰度積分值代表蛋白的表達(dá)量。

1.4 明膠酶譜分析 HT-29細(xì)胞以1×106/孔、含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液接種到六孔板內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。次日用0.01mmol/L PBS(pH7.4)洗滌后,加入無(wú)血清RPMI-1640。分別低氧培養(yǎng)0、6、12、24 和48h,對(duì)照組常氧下培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間,各時(shí)相點(diǎn)設(shè)8個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。收集各時(shí)段點(diǎn)上清液,按照1∶3比例將上清液與上樣緩沖液(62.5mmol/L Tris-Hcl pH6.8,10%甘油,2%十二烷基硫酸鈉,0.1%溴酚藍(lán))混合,進(jìn)行1.5%明膠/8%PAGE、80V 電泳20min、100V 電泳2h。2.5%Triton X-100洗脫凝膠,加入50mmol/L Tris-Hcl pH7.5,0.2 mol/L NaCl,5 mmol/L CaCl2,0.02% Triton X-100,37 ℃孵育24h,再經(jīng)0.4%考馬斯亮藍(lán)R-250、10%冰醋酸、20%甲醇的染色緩沖液和10%冰醋酸、20%甲醇的脫色緩沖液處理,直至凝膠顯現(xiàn)出蛋白負(fù)染條帶。對(duì)負(fù)染條帶用Bio-Rad的圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析,負(fù)染條帶的大小、亮度代表MMP-2/9的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用±s表示,行方差分析或t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 低氧下細(xì)胞核內(nèi)NF-κB 蛋白的表達(dá) 在常氧下的對(duì)照組,HT-29細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB/p65表達(dá)呈低水平。在低氧組,低氧最初6h,HT-29細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB 表達(dá)無(wú)顯著變化,低氧12h后逐漸升高,24h達(dá)到頂峰。低氧各時(shí)段組(除6h組外),NF-κB蛋白的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

圖1 低氧組及對(duì)照組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB/p65蛋白表達(dá)水平

2.2 低氧下MMP-2、MMP-9的活性 MMP-2及其前體溶解明膠后呈現(xiàn)分子量為66×103/72×103的負(fù)染條帶,MMP-9則呈現(xiàn)92×103的負(fù)染條帶,HT-29細(xì)胞分泌的MMP活性以MMP-2及其前體為主。明膠酶譜分析可檢測(cè)出HT-29細(xì)胞在常氧下可分泌一定活性的MMP-2及其前體和MMP-9,低氧最初6h,MMP-2、MMP-9 活性無(wú)顯著變化。低氧12h,HT-29細(xì)胞分泌的MMP-2、MMP-9活性逐漸上調(diào),24h達(dá)頂峰。低氧各時(shí)段組(除6h組外),MMP-2、MMP-9活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.01),見(jiàn)圖2。由此可見(jiàn),低氧可誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞分泌的高活性的MMP2、MMP-9。

圖2 明膠酶譜分析MMP-2/9活性

3 討 論

在人和小鼠的腫瘤組織中,距離血管50~250mm 處即可觀察到低氧細(xì)胞[5]。腫瘤細(xì)胞更傾向于糖酵解,即使在氧氣充足的情況下依然會(huì)進(jìn)行糖酵解,這一過(guò)程被稱為Warburg effect[6]。糖酵解過(guò)程產(chǎn)生的乳酸會(huì)使腫瘤細(xì)胞處于酸性微環(huán)境,這一現(xiàn)象在腫瘤低氧區(qū)表現(xiàn)得更為明顯,實(shí)驗(yàn)表明,低氧腫瘤細(xì)胞內(nèi)pH 值約為7.05,而正常值為7.30。因此,低氧是實(shí)體腫瘤物理外環(huán)境的典型特征。

細(xì)胞外間質(zhì)的微環(huán)境對(duì)實(shí)體腫瘤的惡性表型起著重要的調(diào)控作用。癌細(xì)胞對(duì)低氧的耐受以及演進(jìn)主要依賴缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,HIF)來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。此外,生物體內(nèi)還存在非HIF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而形成了細(xì)胞對(duì)低氧應(yīng)答的特異性和多樣性。

本研究用低氧環(huán)境培養(yǎng)HT-29細(xì)胞并提取細(xì)胞核蛋白,以Western blot分析其細(xì)胞核NF-κB的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在低氧12h后,細(xì)胞核中的NF-κB開(kāi)始升高,低氧24h,細(xì)胞核中的NF-κB已顯著增加,并達(dá)到頂峰。正常情況下NF-κB 以同二聚體或異二聚體存在,并和抑制性蛋白IκB 呈非共價(jià)結(jié)合而不能發(fā)生核轉(zhuǎn)位。IκB 蛋白泛素化和磷酸化后可激活NF-κB 蛋白,但其活化過(guò)程受嚴(yán)格調(diào)控。一旦IκB 被磷酸化,IκB 被含Cull(Cullin蛋白的一種)的多聚泛素連接酶泛素化,進(jìn)而通過(guò)蛋白酶體途徑降解,NF-κB與IκB分離,暴露出核定位信號(hào),激活NF-κB,游離的NF-κB 二聚體進(jìn)入細(xì)胞核,在大量激活子的作用下,NF-κB 復(fù)合體與同源DNA 序列結(jié)合產(chǎn)生基因表達(dá)的效應(yīng)[7]。本研究表明:在低氧誘導(dǎo)下,HT-29細(xì)胞質(zhì)中的NFκB可能經(jīng)某些因素的作用,從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位,具有轉(zhuǎn)化活性、位于細(xì)胞核的NF-κB進(jìn)一步上調(diào)其下游基因。

低氧條件會(huì)誘導(dǎo)癌細(xì)胞分泌許多MMPs和血纖維蛋白溶酶原抑制因子1(PAI-1)等破壞細(xì)胞外基質(zhì)的分子[8-9],從而向基底層擴(kuò)散、浸潤(rùn)。

在腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中,MMP-2/9所起的作用主要取決于其活性。本實(shí)驗(yàn)的明膠酶譜分析顯示:低氧最初6h,MMP-2/9活性無(wú)顯著變化。低氧12h,HT-2/9細(xì)胞分泌的MMP-2/9活性逐漸上調(diào),24h 達(dá)頂峰。低氧各時(shí)段組(除6h 組外),MMP-2/9活性均顯著高于對(duì)照組。高活性的MMP-2/9降解Ⅳ型膠原,為HT-29細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移提供通道。MMPs因?yàn)槿狈θ毖醴磻?yīng)元件(HRE)不受缺氧誘導(dǎo)因子的調(diào)控,這與尿激酶型胞漿素原活化物(uPA)有所不同。鑒于此,低氧時(shí)可能存在另外一條非HIF-1α的途徑調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。當(dāng)整合素受體α1β3被激活后,可活化NF-κB,并使其轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)與MMP-9啟動(dòng)子結(jié)合,上調(diào)MMP-9的表達(dá);NF-κB還可上調(diào)MT1-MMP的表達(dá),使MMP-2的活性進(jìn)一步增強(qiáng)[10-11]。Li等[12]也報(bào)道,在低氧條件下,通過(guò)NF-κB/HIF-1α途徑可上調(diào)MMP-2/9的表達(dá)。

低氧幾乎影響整個(gè)腫瘤細(xì)胞的功能以及改變大多數(shù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性,這些信號(hào)途徑并不是孤立存在的。腫瘤細(xì)胞在適應(yīng)低氧并演進(jìn)過(guò)程中,需要多條信號(hào)通路的協(xié)調(diào),如HIF-1 與NF-κB 協(xié)同作用:一方面,HIF-1可以激活NF-κB;另一方面,低氧激活NF-κB,NF-κB 轉(zhuǎn)入核內(nèi)又能與HIF-1α 啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,上調(diào)HIF-1amRNA 和蛋白水平[13]。此外HIF-1的激活還需要NF-κB 和低氧后翻譯后調(diào)節(jié)機(jī)制的共同調(diào)節(jié)[14],如此形成腫瘤細(xì)胞低氧應(yīng)答的組織特異性和多樣性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):在低氧的誘導(dǎo)下細(xì)胞核中NF-κB和MMP-2/9的活性明顯上調(diào),且上調(diào)趨勢(shì)同步。因此推測(cè):不同與HIF-I,NF-κB可能是低氧下的另一重要調(diào)控途徑,可通過(guò)上調(diào)MMP-2/9的活性使腫瘤細(xì)胞的侵襲性增加。

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