國會艷 劉志華 胡萍 賈園園 張春蕊 楊傳平 王玉成

(牡丹江師范學院，牡丹江，157012) (林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學))

責任編輯:潘 華。

干旱、高鹽以及高溫和低溫等逆境脅迫給植物造成嚴重的傷害，致使植物生長滯后、品質(zhì)下降。植物在逆境脅迫下會產(chǎn)生相應(yīng)的生理應(yīng)答反應(yīng)，減輕或避免逆境給植物帶來的損害。近年來，有大量的研究表明轉(zhuǎn)錄因子在植物的逆境脅迫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用，能夠調(diào)控下游功能基因在特定時間或者特定部位的適量表達，從而實現(xiàn)植物對逆境的脅迫應(yīng)答［1］。因此，對于轉(zhuǎn)錄因子的研究顯得尤為關(guān)鍵。

MYB 轉(zhuǎn)錄因子有著廣泛的生理功能，參與細胞的分化，響應(yīng)激素和環(huán)境因子的應(yīng)答，在植物的次生代謝和葉片等器官的形態(tài)建成等方面具有重要的作用［2］。很多研究發(fā)現(xiàn)，MYB 轉(zhuǎn)錄因子參與植物的逆境脅迫應(yīng)答，Vanninia 等［3］研究發(fā)現(xiàn)水稻的OsMYB4基因在擬南芥中的過表達引起了254 個基因上調(diào)表達，從而使植物的抗寒、抗旱以及耐鹽能力明顯提高。Liao 等［4］在大豆中發(fā)現(xiàn)43 個MYB 基因，它們在鹽、旱、ABA 以及低溫脅迫條件下表達量發(fā)生顯著的變化，利用酵母單雜交和酵母雙雜交等技術(shù)深入研究GmMYB76、GmMYB92 和GmMYB177 這3 個基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GmMYB 基因能夠通過調(diào)控下游的抗逆響應(yīng)基因增強大豆的抗逆能力。一些研究發(fā)現(xiàn)MYB 轉(zhuǎn)錄因子參與植物的次生壁合成，Zhong 等［5］發(fā)現(xiàn)擬南芥的AtMYB46 是次生壁合成相關(guān)的NAC結(jié)構(gòu)蛋白直接調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，能夠促進植物次生細胞壁的形成。Zhong 等［6］研究發(fā)現(xiàn)MYB43、MYB52、MYB54、MYB58 和MYB63 是AtMYB46 直接調(diào)控的下游轉(zhuǎn)錄因子，參與植物次生壁的形成。關(guān)于MYB 轉(zhuǎn)錄因子參與類黃酮生物合成途徑的相關(guān)研究也很多，褐梨的PyMYB10 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)類黃酮的生物合成中起著重要的作用，PyMYB10 基因的過表達能夠誘導花青素的積累［7］;酵母雙雜交實驗證明煙草的一個MYB 轉(zhuǎn)錄因子能夠與5 個BHLH 轉(zhuǎn)錄因子相互作用來誘導花青素的合成［8］。盡管關(guān)于MYB 轉(zhuǎn)錄因子的研究很多，但是它們的功能還沒有被完全的闡述清楚。

轉(zhuǎn)錄因子一般通過與下游基因啟動子上的順式作用元件結(jié)合來調(diào)控下游基因的表達，從而行使其相 應(yīng) 的 功 能。Zhong 等［9］研 究 發(fā) 現(xiàn) 楊 樹 的PtrMYB2/3/20/21 通過與ACC(A/T)A(A/C)(T/C)元件結(jié)合促進植物次生細胞壁的形成;AtMYB61結(jié)合ACCTAC 元件，能夠調(diào)節(jié)木質(zhì)部細胞分化、側(cè)根生長和改變氣孔的大?。?0］。Kim 等［11］研究發(fā)現(xiàn)擬南芥的AtMYB46 能夠與(A/G)(G/T)T(A/T)GGT(A/G)元件結(jié)合，是植物次生細胞壁合成過程中的主要開關(guān)基因。由此看來，研究轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的互作是非常重要的，酵母單雜交和電泳遷移率實驗是研究轉(zhuǎn)錄因子與元件互作的常用并且有效的方法。Wang 等［12］利用酵母單雜交技術(shù)證明檉柳的ThERF1 轉(zhuǎn)錄因子能夠與GCC- box 和DRE 元件結(jié)合，從而增強了檉柳的抗旱和耐鹽能力;Zhong 等［6］利用電泳遷移率實驗證明AtMYB46和AtMYB83 能夠與ACC(A/T)A(A/C)(T/C)元件結(jié)合促進擬南芥次生壁的形成。

原核蛋白的表達是進行電泳遷移率試驗的前期基礎(chǔ)，因此獲得高濃度與純度的原核蛋白尤為關(guān)鍵。目前很難對植物體內(nèi)某一特定蛋白進行提取，所以一般將其轉(zhuǎn)入原核表達細胞中進行表達來收集蛋白，而植物的轉(zhuǎn)錄因子屬于真核蛋白，在原核細胞中可能不表達或表達量很低，因此必須進行試驗條件的摸索和優(yōu)化才能使蛋白表達并獲得高濃度與純度的蛋白。本試驗將白樺的一個MYB 轉(zhuǎn)錄因子BplMYB46 構(gòu)建到原核表達載體pGEX-4T-2 上，利用IPTG 誘導重組蛋白的表達，并進行實驗條件的摸索獲得了濃度和純度較高的重組蛋白，為后續(xù)的電泳遷移率試驗提供了基礎(chǔ)，從而能夠分析MYB轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的互作，為進一步研究MYB 轉(zhuǎn)錄因子的功能提供一個新思路。

1 材料與方法

大腸桿菌感受態(tài)細胞Top10 為本實驗室保存;原核蛋白表達載體pGEX4T-2(含有谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶，glutathione S-transferase，GST 標簽)購自GE Healthcare 公司;BamH I 和Not I 限制性內(nèi)切酶購自Promega 公司;Ex Taq，dNTP 和T4 DNA 連接酶等購自TaKaRa 公司;質(zhì)粒小提試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒和膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA 公司;其它試劑購自哈爾濱伊士達生物有限公司。

1.1 目的基因的擴增

根據(jù)BplMYB46 的基因序列特點和表達載體的限制性內(nèi)切酶的識別位點設(shè)計引物，并在引物的正義鏈和反義鏈的5'端引入BamH I 和Not I 的酶切位點，引物序列為MYB-F:5'-GCGCGGATCCATGAGGAAGCCGGAGGCCT-3';MYB-R:5'-CATGGCGGCCGCCTGAACTTGGAAATCAAG-3';其中帶有下劃線的堿基表示酶切位點，為防止基因編碼氨基酸時發(fā)生移碼突變，帶有方框的堿基是人為添加堿基序列。以pROK2-BplMYB46 質(zhì)粒為模板，進行PCR 擴增，擴增體系為:10 ×Ex Taq buffer 2 μL，MYB-F 引物0.5 μL，MYB-R 引物0.5 μL，dNTP 0.4 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.2 μL，模板0.5 μL，去離子水補足體積至20 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)，72 ℃復性7 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，采用膠回收試劑盒對目的基因的片段進行純化回收。

1.2 氨基酸序列分析

在白樺的轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)BplMYB46 轉(zhuǎn)錄因子，利 用Expasy 在 線 工 具(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)查找BplMYB46 蛋白的分子量和等電點;并利用Bioedit 軟件將BplMYB46 與擬南芥的MYB 類轉(zhuǎn)錄因子進行氨基酸序列比對分析。

1.3 原核蛋白表達載體的構(gòu)建

利用質(zhì)粒小提試劑盒提取pGEX4T-2 的質(zhì)粒，使用BamH I 和Not I 限制性內(nèi)切酶對目的基因DNA 片段和pGEX4T-2 質(zhì)粒分別進行雙酶切，條件為37 ℃，6 h。然后采用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒將酶切后的目的基因和線性化載體進行純化回收。然后利用T4 連接酶將BplMYB46 基因與pGEX4T-2線性化載體在16 ℃下過夜連接，次日，采用42 ℃熱激法將連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10 感受態(tài)細胞中，于37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取平板上的單克隆菌落于LB 液體培養(yǎng)基(氨芐終質(zhì)量濃度為50 mg/L)中進行活化，然后以菌液為模板進行PCR 檢測，將陽性菌株對應(yīng)的菌液送至上海生工生物技術(shù)有限公司(http://www.sangon.com/sangon)測序。提取測序成功對應(yīng)的菌液的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入BL21 原核表達感受態(tài)細胞中，然后進行菌液PCR 檢測，將檢測成功的菌液保存到冰箱中-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 重組蛋白的誘導表達

首先將保存于冰箱中的菌液在10 mL LB 液體培養(yǎng)基(氨芐終質(zhì)量濃度為50 mg/L)中進行活化，37 ℃震蕩培養(yǎng)箱中160 r/min 過夜培養(yǎng)。次日，在OD600為0.5，30 ℃培養(yǎng)溫度下，IPTG(終濃度為0.5 mmol/L)分別誘導0、2、4、6 h，收集2 mL 菌液，4 ℃，12 000 r/min 離心5 min。棄上清，向沉淀中加入1 mL 的1x 上樣緩沖液，振蕩混勻，煮沸5 min，4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，取上清進行SDS-PAGE電泳，同時以pGEX-4T-2 空載為對照。電泳結(jié)束后進行考馬斯亮藍染色，脫色后照相保存。

然后進行不同的IPTG 濃度0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L 的誘導，在30 ℃培養(yǎng)4 h，分別收集沉淀和上清進行SDS-PAGE 電泳;IPTG 濃度為0.4 mmol/L，分別在16、30、37 ℃培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)4 h，分別收集沉淀和上清進行SDS-PAGE 電泳。

1.5 重組蛋白的純化

尿素溶解方式。沉淀用50 mL 2% Triton(PBS)重懸，振蕩30 min，10 000 r/min 常溫離心10 min，棄上清，沉淀用50 mL Buffer I(Buffer I:20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl)重懸，超聲波處理5 min，10 000 r/min 常溫離心10 min，棄上清，沉淀用50 mL 2% Triton 重懸，振蕩30 min，10 000 r/min 常溫離心10 min，棄上清，沉淀用50 mL Buffer I 重懸，10 000 rpm 常溫離心10 min，棄上清，沉淀用2、4 以及8 mol/L Urea/Buffer I 重懸，37 ℃過夜攪拌，SDS-PAGE 檢測。

電洗脫方式。向沉淀中加入包涵體洗脫液，37℃振蕩30 min，4 ℃下10 000 r/min 離心10 min，重復上述步驟3 次，將洗滌好的包涵體沉淀用溶解液充分溶解，在大板SDS-PAGE 中電泳，切下目的條帶，置于透析袋中，加入蛋白洗脫緩沖液，4 ℃下120 V 電泳4 h，SDS-PAGE 檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 BplMYB46 基因的PCR 擴增和序列分析

以pROK2-BplMYB46 重組質(zhì)粒為模板，進行PCR 擴增。BplMYB46 基因的開放閱讀框全長915 bp。BplMYB46 基因編碼304 個氨基酸，分子量為34.4 kD，等電點為5.95。將BplMYB46 轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥的MYB 類轉(zhuǎn)錄因子進行了氨基酸序列多重比對分析，擬南芥的MYB 轉(zhuǎn)錄因子包括AtMYB46、AtMYB85、AtMYB103、AtMYB52、AtMYB54、AtMYB43、AtMYB42、AtMYB69 和 AtMYB20 (GenBank ID:AED91824、NP_567664、AF048839_1、NP_173237、AEE35458、AED92315、NP_567390、AEE86226、NP_176797)，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看到，這些MYB 轉(zhuǎn)錄因子有2 個DNA 保守區(qū)，在第25 個氨基酸到第74 個氨基酸為一個R 區(qū)，第78 個氨基酸到124 個氨基酸為另一個R 區(qū)，所以BplMYB46 屬于R2R3-MYB 類轉(zhuǎn)錄因子。

圖1 白樺BplMYB46 轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥MYB 類轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列多重比對

2.2 BplMYB46 基因原核蛋白表達載體的構(gòu)建

使用 BamH I 和 Not I 限制性內(nèi)切酶將BplMYB46 基因PCR 擴增獲得的膠回收產(chǎn)物和pGEX4T-2 質(zhì)粒分別進行雙酶切后，利用T4 連接酶將基因和載體的酶切產(chǎn)物進行連接，然后進行大腸桿菌轉(zhuǎn)化試驗。挑取單克隆活化后進行菌液PCR 檢測，結(jié)果如圖2所示。一共挑取6 個單菌落，以對應(yīng)的菌液為模板，并以去離子水為陰性對照進行PCR 檢測，目的條帶為915 bp，從圖2中可以看到擴增的片段大小接近1 kb，初步說明條帶正確，將菌液測序后的序列與BplMYB46 基因序列進行比對，結(jié)果保持一致，說明原核蛋白表達載體構(gòu)建成功。

圖2 原核蛋白表達載體構(gòu)建PCR 檢測結(jié)果

2.3 BplMYB46 蛋白在原核中的表達

IPTG 終濃度為0.5 mmol/L，30 ℃160 r/min 分別誘導0、2、4、6 h 后，SDS-PAGE 檢測結(jié)果如圖3。BplMYB46 蛋白為34.4 kD，加上載體pGEX4T-2中的GST 標簽蛋白26 kD，目的蛋白大約為60 kD。

從圖3中可以看到2～4 號泳道的空載對照在26 kD 處有蛋白表達，6～8 號泳道在72 和45 kD 之間處有一條明顯的不同于空載對照的條帶，可能是目的蛋白。從圖3中看到，在誘導時間為0 h(1，5號泳道)幾乎沒有蛋白的表達，隨著誘導時間的延長，重組蛋白的表達量隨之增加，但誘導4 和6 h(7，8 號泳道)的差別不大。所以后續(xù)試驗誘導時間設(shè)為4 h。

圖3 IPTG 誘導BplMYB46 蛋白表達檢測

IPTG 濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L 進行誘導后，電泳結(jié)果如圖4A。從圖中可以看到，5～8 號泳道在72 和45 kD 之間有明顯的條帶，而1～4 號泳道沒有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)，說明重組蛋白主要以包涵體形式存在。當IPTG 濃度在0.4～0.8 mmol/L時重組蛋白表達量相差不多，說明IPTG 的濃度對重組蛋白表達量的影響不大，后續(xù)實驗選擇IPTG濃度為0.4 mmol/L 進行重組蛋白的誘導表達。

IPTG 濃度為0.4 mmol/L，分別在16、30、37 ℃培養(yǎng)溫度下誘導培養(yǎng)4 h 后，電泳結(jié)果如圖4B 所示。從圖中可以看到，1～3 號泳道在72 和45 kD 之間有明顯的條帶，而4～6 號泳道沒有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)，重組蛋白仍以包涵體形式存在。誘導溫度在30℃時重組蛋白的表達量較16 ℃時要高，在37 ℃時重組蛋白的表達量最高，但是雜蛋白的濃度也有所提高，所以后續(xù)實驗選擇30 ℃條件下誘導重組蛋白的表達。

圖4 不同IPTG 濃度及溫度下誘導BplMYB46 蛋白表達檢測

2.4 BplMYB46 蛋白的純化

2.4.1 尿素溶解方式進行蛋白純化

以2、4 以及8 mol/L Urea/Buffer I 溶解沉淀后，SDS-PAGE 檢測結(jié)果如圖5，圖中1 號、2 號和3 號泳道分別為2、4、8 mol/L 的Urea/Buffer I 溶解后的BplMYB46 蛋白，結(jié)果顯示1 號泳道蛋白表達量很微弱，2 號泳道蛋白表達量較3 號低，3 泳道蛋白表達量最高，但仍含有雜蛋白。

2.4.2 電洗脫方式進行蛋白純化

以電洗脫方式進行蛋白純化后，SDS-PAGE 檢測結(jié)果如圖6，圖中的1 號泳道為GST 標簽蛋白，2號為30 ℃誘導的包涵體蛋白，3 號為包涵體復性，4號為電洗脫之后的蛋白，從圖中可以看到經(jīng)過電洗脫之后的目的蛋白濃度高，且較為單一，說明電洗脫效果較好。

圖5 尿素溶解純化蛋白檢測

圖6 電洗脫純化蛋白檢測

3 結(jié)論與討論

電泳遷移率實驗(EMSA)是一種研究DNA 結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA 結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。目前，這一技術(shù)在轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的互作分析中被廣泛的應(yīng)用，而原核蛋白表達是研究轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件互作的前期基礎(chǔ)。陳雪燕等［13］對黑麥的ScMYB 的原核蛋白表達進行了各種影響因素的優(yōu)化，結(jié)果顯示IPTG 濃度對重組蛋白的表達無顯著影響，誘導溫度在37 ℃，誘導時間為4 h，菌液OD 值在0.6～1.0 時重組蛋白的表達量最高。劉勝男等［14］從檉柳中克隆一個bZⅠP1 基因，將其構(gòu)建到pGEX-4T-2 載體上，通過條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)IPTG 為1.0 mmol/L，37 ℃下誘導4 h，所獲得重組蛋白rThbZIP1 表達量最大，利用電洗脫法純化目的蛋白，為下一步研究bZIP1 轉(zhuǎn)錄因子蛋白活性及與特定元件結(jié)合的驗證試驗提供了基礎(chǔ)。

本試驗首先將白樺的一個MYB 轉(zhuǎn)錄因子—BplMYB46 構(gòu)建到原核表達載體上，通過IPTG 誘導發(fā)現(xiàn)BplMYB46 表達蛋白為包涵體形式，采用尿素梯度透析法和電洗脫法進行試驗條件的摸索和優(yōu)化，結(jié)果顯示電洗脫法得到的蛋白濃度和純度較高。本研究為下一步利用EMSA 試驗研究BplMYB46 與下游基因啟動子上的順式作用元件的互作提供了前期條件，從而為研究BplMYB46 在白樺中的功能做了充分的準備。

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