腰政懋 徐程揚 李樂

(省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室(北京林業(yè)大學)，北京，100083)

責任編輯:潘 華。

核糖體DNA(ribosomal DNA，rDNA)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)中的ITS1(介于18S 和5.8S 之間)和ITS2(介于5.8S 和26S 之間)序列作為非編碼區(qū)(Non-Coding Region)，承受的選擇壓力較小，進化速率較快［1］，且與植物生活型呈相關(guān)性［2］，可以提供豐富的遺傳分析所需要的序列及位點信息。rDNA ITS 序列分析已被廣泛應(yīng)用于植物種間或種內(nèi)遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究［3-6］，但對冷杉屬(Abies)植物進行rDNA ITS 序列分析的報道仍然較少，僅有向巧萍等［7］曾對rDNA ITS 序列在28種冷杉屬植物中的長度多態(tài)性進行了研究。

遼東冷杉(Abies holophylla)為松科冷杉屬常綠喬木，別名沙松，原產(chǎn)于我國東北牡丹江流域山區(qū)、長白山區(qū)及遼寧東部山區(qū)的氣候寒冷濕潤地帶，生長較快、材質(zhì)優(yōu)良、抗病蟲害能力強，是溫帶針闊混交林中的主要用材樹種之一。目前，天然林中遼東冷杉資源急劇減少，林相殘缺破碎［8］，生境片斷化嚴重，亟需得到保護。目前有關(guān)遼東冷杉遺傳多樣性的研究集中在形態(tài)學水平［9-10］，DNA 分子水平的遺傳多樣性研究未見報道。

本研究采用PCR 擴增產(chǎn)物直接測序的方法，對6 個種源遼東冷杉的rDNA ITS 序列進行測定與分析，首次從DNA 分子水平上比較遼東冷杉種源間的差異并分析其親緣關(guān)系，旨在探討遼東冷杉種內(nèi)變異程度及遺傳多樣性，為遼東冷杉種質(zhì)資源的保護和栽培利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料的采集和保存

試驗材料來自我國東北地區(qū)的黑龍江省寧安市，吉林省敦化市、和龍市、撫松縣，遼寧省清原滿族自治縣和寬甸滿族自治縣，基本覆蓋了遼東冷杉的整個天然分布區(qū)，共計6 個種源90 個樣本。各種源地的具體情況詳見表1。采樣過程中按照均勻分布、隨機取樣的原則進行采樣，保證采樣母樹的間距在50 m 以上。采樣時所選葉片均為新鮮幼嫩葉片，采后用變色硅膠干燥法保存。帶回到實驗室后置于超低溫冰箱-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 東北地區(qū)遼東冷杉6 個種源地的基本情況

1.2 基因組DNA 的提取

采用Ezup 柱式植物基因組DNA 抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取各干燥葉片樣品的總DNA，按試劑盒操作指南進行。提取后用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其濃度與純度，統(tǒng)一稀釋到50 mg·L-1，置于冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR 擴增

使用真核生物rDNA ITS 序列的通用引物，上游引物ITS-1 的序列為:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，位于18S 上;下游引物ITS-4 的序列為:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，位于26S 上。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR 擴增反應(yīng)在ABI 2720 Thermal Cycler(Applied Biosystems Inc.，USA)中進行。以5 個種源遼東冷杉的rDNA 為模板進行ITS1-5.8S-ITS2 整段擴增，PCR 反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中包括50 mg·L-1模板DNA 0.5 μL，10 μmol·L-1引物各0.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 1 μL，5 ×PCR 緩沖液2.5 μL，2 U·μL-1Taq DNA 聚合酶0.2 μL，加入dH2O 補足。上述試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。PCR 擴增程序為94 ℃預變性4 min;94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán);72 ℃再延伸10 min。擴增產(chǎn)物于4 ℃下保存。

反應(yīng)結(jié)束后，以DNA Ladder Mix maker(生工生物工程(上海)股份有限公司)作為分子量標記，用1%的瓊脂糖凝膠電泳(電壓150 V，電流100 mA，時間20 min)檢測PCR 擴增產(chǎn)物，電泳結(jié)果在FR980型凝膠成像儀(上海復日科技儀器有限公司)中觀察和拍照。

1.4 PCR 擴增產(chǎn)物的純化和測序

使用SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)對擴增的rDNA ITS片段進行純化，按試劑盒操作指南進行。將純化后的PCR 產(chǎn)物作為測序反應(yīng)的模板，用PCR 反應(yīng)的引物作為測序引物直接測序。序列測定在ABI 3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems Inc.，USA)中完成。

1.5 序列分析方法

所得序列使用NCBI(National Center for Biotechnology Information，USA)的在線BLAST 程序進行同源檢索;使用Clustal X(Version 2.0)［11］軟件進行對位排列和多重比對，并輔以人工校對;使用分子進化遺傳分析軟件MEGA(Version 6.0)［12］軟件分析堿基組成、(G+C)含量、DNA 序列差異百分率和堿基置換數(shù)，并用Kimura 2-Parameter 模型(K2P Model)構(gòu)建序列遺傳距離矩陣，NJ 法(Neighbor- Joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。系統(tǒng)發(fā)生樹各分支的置信度用自覺檢驗法(Bootstrap Test)檢驗，共進行1 000次循環(huán)，以評價各分支的系統(tǒng)學意義及可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 遼東冷杉rDNA ITS 序列PCR 擴增產(chǎn)物的電泳分析

以6 個種源遼東冷杉基因組DNA 為模板進行rDNA ITS 序列的PCR 擴增反應(yīng)，PCR 擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，6 個種源遼東冷杉的rDNA ITS 序列的PCR 擴增產(chǎn)物均在1 200～1 500 bp 處有1 條清晰的特異性條帶。

2.2 遼東冷杉rDNA ITS 序列的長度

將遼東冷杉在NCBI 中進行在線Blast 比對，發(fā)現(xiàn)GenBank 中尚沒有遼東冷杉rDNA ITS 序列的登錄，因此參考冷杉屬其他樹種如秦嶺冷杉(Abies chensiensis)(登錄號EF057702.1)、資源冷杉(Abies ziyuanensis)(登錄號EF057704.1)和臭冷杉(Abies nephrolepis)(登錄號EF057712.1)的rDNA ITS 序列，分析確定了遼東冷杉rDNA ITS 序列中ITS1 和ITS2 與3 個編碼區(qū)18S、5.8S、26S 的界限，并使用NCBI 在線工具BankIt 向GenBank 提交了遼東冷杉的rDNA ITS 序列(登錄號KT164592)。

6 個種源遼東冷杉rDNA ITS 全序列長度均為1 355 bp，其中ITS1 序列長度為1 162 bp，5.8S 編碼區(qū)序列長度為162 bp，ITS2 序列長度僅為71 bp，較短。各區(qū)在種源間均未發(fā)生長度變異。

2.3 遼東冷杉rDNA ITS 序列的堿基變異

6 個種源遼東冷杉的rDNA ITS 序列的堿基變異較少，只有8 個位點發(fā)生了變異，均位于ITS1 序列上。其中6 個位點發(fā)生了A—G 或C—T 堿基轉(zhuǎn)換，2 個位點G—C 或G—T 堿基顛換，無插入或缺失變異(表2)。5.8S 編碼區(qū)序列和ITS2 序列均非常保守，沒有變異位點。清原和寬甸種源的rDNA ITS 序列完全一致，寧安和敦化種源均各有1 個位點變異，和龍和撫松種源變異位點較多，均為4 個。

表2 6 個種源遼東冷杉rDNA ITS 序列的堿基變異位點

2.4 遼東冷杉rDNA ITS 序列的堿基含量

6 個種源遼東冷杉的ITS1 序列中各堿基的含量存在明顯差異(表3)，其中鳥嘌呤G 含量最高，腺嘌呤A 含量最低，(G + C)含量在60.24%～60.59%，基本相等;ITS2 序列中各堿基的含量也存在明顯差異，從16.13%～38.71%不等，其中胞嘧啶C含量最高，胸腺嘧啶T 含量最低，(G +C)含量均為58.06%。ITS1 和ITS2 序列中(G +C)含量均明顯高于(A+T)含量。不同物種的(G +C)含量不同，物種間的親緣關(guān)系越近，(G + C)含量差異越?。?3-14］。種源間(G +C)含量差異極小，也說明遼東冷杉種源間親緣關(guān)系非常近。

表3 6 個種源遼東冷杉rDNA ITS 序列的堿基含量 %

2.5 遼東冷杉rDNA ITS 序列間的遺傳距離

根據(jù)Kimura 2-parameter 模型(K2P model)構(gòu)建的遼東冷杉rDNA ITS 序列種源間遺傳距離矩陣(表4)顯示，清原種源與寬甸種源的遺傳距離最小，為0，表明它們的序列同源性最高，親緣關(guān)系極近;清原和寬甸種源均與和龍和撫松種源間的遺傳距離最大，為0.003 7，親緣關(guān)系最遠;其它種源間遺傳距離也在0.000 7～0.003 0;遺傳距離平均值為0.002 3，表明遼東冷杉種源間親緣關(guān)系較近，遺傳變異程度較低。

表4 6 個種源遼東冷杉rDNA ITS 序列間的遺傳距離

2.6 遼東冷杉rDNA ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)生樹

基于6 個種源遼東冷杉rDNA ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)生樹(圖1)表明，地理距離相近的種源聚在一起。位于黑龍江省東南部的寧安種源與相鄰的位于吉林省東北部的敦化種源即牡丹江流域的兩個種源聚在一起，位于長白山區(qū)的吉林省的和龍和撫松種源也聚在一起，并與上述兩個種源共同聚為一個大類;位于遼寧省東部的清原和寬甸種源聚在一起，單獨聚為一個大類。這與遺傳距離分析所得的結(jié)果一致，表明遼東冷杉rDNA ITS 序列的差異與其地理分布相關(guān)性較高，地理距離相近則遺傳距離也較近，表現(xiàn)出一定的分子地域性差異。

圖1 基于6 個種源遼東冷杉rDNA ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)生樹

3 結(jié)論與討論

rDNA 在不同物種間存在豐富變異，核苷酸序列變化大，可以提供詳盡的遺傳學信息［15］，相對于線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)和葉綠體DNA(Chloroplast DNA，cpDNA)，其受到細胞核保護機制的保護，進化過程穩(wěn)定，且其ITS1、ITS2 序列的間隔區(qū)(18S、5.8S 和26S rDNA)極為保守，能夠用通用引物進行擴增及直接測序［16-17］。因此，非常適用于種以上水平的系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定研究，在裸子植物中，已先后應(yīng)用于鐵杉屬(Tsuga)［18］、松屬(Pinus)［19］、落葉松屬(Larix)［20］、黃杉屬(Pseudotsuga)［20］、冷杉屬(Abies)［7］和云杉屬(Picea)［21］等。但在鑒別種內(nèi)差異方面，其應(yīng)用價值則因種而異［22-24］。

裸子植物的rDNA ITS 序列長度(包括ITS1、ITS2 和5.8S rDNA)介于975～3 125 bp 之間，平均長度約為1 500 bp［25］，明顯大于被子植物的565～700 bp［26］。向巧萍等［7］對28 種冷杉屬植物rDNA ITS 序列長度的研究發(fā)現(xiàn)分布于歐亞大陸和其它分布于北美的冷杉屬植物的rDNA ITS 全序列長度約為1 700 bp。本研究結(jié)果認為6 個種源遼東冷杉rDNA ITS 序列總長度均為1 355 bp，與裸子植物rDNA ITS 序列的平均長度相近，但稍短于1 700 bp，這可能與物種差異及測序引物不同有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)不同種源遼東冷杉rDNA ITS 序列堿基變異位點較少，僅有8 個，均位于ITS1 序列上，而且變異類型也不豐富，僅有堿基置換(包括堿基轉(zhuǎn)換和顛換)這一種類型，沒有堿基插入或缺失變異，甚至清原種源和寬甸種源的rDNA ITS 序列完全一致，且序列長度分析表明ITS1 序列、ITS2 序列和5.8S rDNA 序列在6 個種源間均未發(fā)生長度變異，說明遼東冷杉rDNA ITS 序列整體具有較高的保守性。這不利于使用rDNA ITS 序列分析的方法對遼東冷杉進行精準的種源鑒定，也提示rDNA ITS 序列在種內(nèi)差異鑒別方面的應(yīng)用有一定的局限性［27］。

遼東冷杉rDNA ITS 序列種源間(G+C)含量差異極小和遺傳距離平均值僅為0.002 3，均表明遼東冷杉種源間親緣關(guān)系較近，遺傳變異程度較低。由于冷杉植物的生長對于溫度有著較嚴格的要求，因此第四紀溫度的變化尤其是末次盛冰期對世界現(xiàn)代冷杉屬植物的分布格局的形成起著決定性的作用［28］。在冰期，大多數(shù)高緯度地區(qū)物種必須退縮到冰期避難所或者分布范圍原地急速收縮，在冰期結(jié)束后，這些物種在當?shù)財U張范圍或回遷到它們從前的分布區(qū)域，伴隨該過程的奠基者效應(yīng)和瓶頸效應(yīng)不可避免地降低種群內(nèi)和物種內(nèi)的多樣性［29］，遼東冷杉作為分布在我國東北高緯度地區(qū)的樹種，不可避免地經(jīng)歷了這一分布“收縮—擴張”的過程，導致其種源間遺傳多樣性較低。

植物種群遺傳變異的分布情形與該種的地理分布情形和生態(tài)特征密切相關(guān)［30］。在對植物使用rDNA ITS 序列分析進行的遺傳多樣性研究中，種源間遺傳距離與地理距離間是否存在顯著的相關(guān)性并沒有統(tǒng)一的結(jié)論［31-32］。根據(jù)NJ 法構(gòu)建的遼東冷杉系統(tǒng)發(fā)生樹基本上將分布區(qū)地理距離較近的種源聚在一起，遼東冷杉6 個種源呈現(xiàn)出明顯的地域分布規(guī)律。這表明遼東冷杉種源遺傳距離與地理空間距離有明顯的相關(guān)性，即如果種源間的地理距離較近，其遺傳距離也相對較小。

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