王顏波 常英英 梁立雄 蘇曉華 張冰玉 楊帆 劉秀華 王建革

(江西農(nóng)業(yè)大學，南昌，330045) (林木遺傳育種國家重點實驗室(中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所)) (江西農(nóng)業(yè)大學)

責任編輯:潘 華。

穩(wěn)定高效的再生體系是遺傳轉化的重要前提。楊樹是我國重要的栽培樹種，在世界上也占有重要地位。一般說來，白楊派樹種的組培再生體系已經(jīng)較為成熟，黑楊派樹種則相對較為困難。近年來，黑楊派樹種的再生及遺傳轉化已在國內(nèi)外科學家的努力下取得了巨大進步［1-5］。于志水等［6］探索了黑楊派樹種組培體系，通過不同外植體分化得到無菌苗，并且篩選了培養(yǎng)基配方，得到了繼代和生根苗。康薇等人［7］篩選出了美洲黑楊(Populus deltoides)離體葉片分化和生根的最適培養(yǎng)基，建立了組培再生體系。周洲［8］等人采用蛭石為基質，使歐美楊108(Populus × euramericana)、歐美楊2001(Populus ×euramericana)、歐美楊107(Populus ×euramericana)生根，并顯著提高生根苗繼代培養(yǎng)和移栽成活率。崔旭東等［9］還發(fā)現(xiàn)卡那霉素可以抑制渤豐1 號楊(Populus×euramericana cl.‘Bofeng 1’)葉片的誘導與分化，增加Cu2+質量濃度能顯著促進渤豐1 號楊不定芽的誘導和分化。

在楊樹育種資源中，黑楊派樹種是重要基因供體。本研究以歐洲黑楊N46 無性系的腋芽無菌萌發(fā)的幼嫩葉片為試驗材料，研究了不同激素組合配比、培養(yǎng)溫度等因素對不定芽誘導和生根的影響，建立了無性系的再生體系，為楊樹快速繁育和遺傳改良提供借鑒。

1 材料與方法

2014年4月自中國林業(yè)科學研究院科研溫室中采取生長健壯無病的1年生歐洲黑楊N46 無性系含腋芽的莖段，消毒后在MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取腋芽無菌萌發(fā)的幼嫩葉片作為試驗材料。

取含腋芽的莖段，流水沖洗2 h，75%乙醇處理1 min;接著用含0.02% tween-20 的2% NaClO 液中處理10 min，最后用無菌水沖洗4 次。接種于不加任何激素的MS 培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

最適分化培養(yǎng)基的選擇:待MS 培養(yǎng)基上莖段上的腋芽萌發(fā)至3～4 cm 時，取生長健壯的腋芽自上而下第3、4 個葉片，切去邊緣，正面朝下平鋪于分化培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基成份采用正交設計4 因素3 水平L9(34)表設計，共9 個處理，每個處理接種10 個無菌葉片，3 次重復。暗培養(yǎng)48 h 后，轉到光下培養(yǎng)。光照強度2 300 lx，光周期16 h/8 h。每7 d 觀察1 次，培養(yǎng)21 d 后統(tǒng)計不定芽的分化情況。

最適生根培養(yǎng)基的選擇:選取生長健壯且長度大于1 cm 的不定芽接種在生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基成份采用正交設計4 因素3 水平L9(34)表設計，共9個處理，每處理10 個不定芽，3 次重復。7 d 后每天觀察1 次，第15 d 統(tǒng)計不定芽的生根情況。

再生苗的移植:當組培苗高度達10 cm 時，在自然條件下封口煉苗3 d，之后用鑷子將苗小心取出，然后用清水洗去根部培養(yǎng)基，用1.5%多菌靈溶液浸泡1 min，再將其移植到拌有1.5%多菌靈溶液的V(草炭土)∶ V(珍珠巖)=5∶ 1 的基質中，澆透水，并用塑料薄膜罩于營養(yǎng)缽上保濕。15 d 后，揭去塑料薄膜進行培養(yǎng)，30 d 后統(tǒng)計成活率。

存活率=(存活的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%;生根率=(生根的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%。采用SPSS17.0 對試驗觀測數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析，在F0.05水平上進行差異顯著性檢驗后，用新復極差(SSR)法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 最適分化培養(yǎng)基的選擇

葉片接入7 d 后，葉片出現(xiàn)卷曲，葉脈處出現(xiàn)膨大，葉片邊緣傷口處出現(xiàn)淡黃色愈傷，個別呈現(xiàn)淡綠色。14 d 后，愈傷組織顏色加深，不定芽開始形成。21 d 后不定芽大量出現(xiàn)，單芽、雙芽和叢生芽均有。不同分化培養(yǎng)基對不定芽誘導的結果及多重比較見表1。

表1 不同分化培養(yǎng)基對不定芽誘導的結果

根據(jù)表1中Ki(其中一個因素水平號為i 時分化芽數(shù)的平均值)值可知，6-BA 質量濃度從0.8下降到0.3 mg·L-1過程中平均分化不定芽數(shù)先上升后下降，在6-BA 質量濃度為0.5 mg·L-1時最高;NAA 質量濃度在從0.08 到0.03 mg·L-1過程中平均分化不定芽數(shù)呈上升趨勢;隨著溫度的上升，不定芽數(shù)先下降后上升，在27 ℃時最高，凝固劑瓊脂粉中分化不定芽數(shù)略微高于植物凝膠。根據(jù)各因素3 個水平的極差R 判斷，4 個因素對不定芽誘導的影響程度為A ＞B ＞C ＞D。依據(jù)表中的Ki的最大值可知，最適分化培養(yǎng)基為:A2B3C3D2，即MS +6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.03 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+0.5%瓊脂粉，最佳誘導溫度為27 ℃(見圖1)。

2.2 最適生根培養(yǎng)基的選擇

不同生根培養(yǎng)基對不定芽生根的影響的結果見表2。將1.5 cm 長左右的不定芽切下，接入生根培養(yǎng)基。在5 d 后開始多數(shù)處理出現(xiàn)乳白色根點，8 d后，第7、8、9 處理的根清晰可見，根數(shù)在6～10 條不等。15 d 時第9 處理的根長可達4～5 cm，主根明顯，須根茂密。

根據(jù)表2中ki值可知，IBA 與NAA 質量濃度在從0.1 降到0.01 mg·L-1過程中生根率均呈上升趨勢;隨著溫度的上升，生根率先上升后下降，在25 ℃時最高，凝固劑瓊脂粉中生根率略微高于植物凝膠。依據(jù)各因素3 個水平的極差R 判斷4 個因素的影響程度為A ＞B ＞C ＞D，根據(jù)表中的Ki的最大值可知，最佳分化培養(yǎng)基為:A3B3C2D2，即1/2MS +IBA0.01 mg·L-1+NAA0.01 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+ 0.5%瓊脂粉，最佳生根溫度為25 ℃(見圖1)。

圖1 最佳培養(yǎng)基上不定芽的誘導和生根情況

表2 不同生根培養(yǎng)基對不定芽生根的影響

3 結論與討論

本研究建立了歐洲黑楊N46 無性系高效穩(wěn)定的不定芽誘導和植株再生體系:幼嫩葉片進行不定芽分化誘導的最適培養(yǎng)基為MS +6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.03 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂粉5 g·L-1，誘導最佳溫度為27 ℃，每個葉片平均分化不定芽數(shù)量可達45.20 個;不定芽生根的最佳培養(yǎng)基為1/2MS + IBA0.01 mg·L-1+NAA0.01 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂粉5 g·L-1，生根最佳溫度為25 ℃，生根率可達93.33%，生根小植株移栽成活率達98%。

培養(yǎng)基中激素的種類及配比是影響外植體分化和不定芽誘導的關鍵因素，調節(jié)其水平及配比是建立和優(yōu)化再生體系的有效手段［10］。有研究認為，培養(yǎng)基中激素的相對含量控制植物不定芽的分化及器官形成，并非其絕對含量［11］。然而一些針對楊屬植物不定芽誘導的研究結果迥異，激素的絕對含量相差無幾，而相對含量相差甚大。王金貴［12］篩選出的的俄羅斯抗寒楊(Populus alba)不定芽的誘導培養(yǎng)基中6-BA 與NAA 的絕對質量濃度為0.5 mg·L-1和0.2 mg·L-1。崔莉潔［13］等人研究來源于阿塞拜疆共和國巴庫地區(qū)的歐洲黑楊(Populus nigra)最適的不定芽誘導培養(yǎng)基中6-BA 與IBA 的絕對質量濃度為1 mg·L-1和0.25 mg·L-1。崔旭東［9］研究的歐美楊渤豐1 號分化培養(yǎng)基中6- BA 與NAA 的絕對質量濃度為0.4 mg·L-1和0.04 mg·L-1。本研究中歐洲黑煙N46 最適的分化培養(yǎng)基中6-BA 與NAA 的絕對質量濃度為0.5 mg·L-1和0.03 mg·L-1。激素6-BA 的質量濃度在0.4～1.0 mg·L-1，NAA 的質量濃度在0.03～0.2 mg·L-1，絕對質量濃度相差不大，而相對質量濃度相差懸殊，從2.5 倍到17 倍不等，均取得了良好的分化效果。由此可見，培養(yǎng)基中激素的相對質量濃度和絕對質量濃度均是不定芽誘導的影響因素，其種類及配比因物種而異。

對于不定芽的生根培養(yǎng)基存在不同的觀點，均取得了良好的生根效果。洪震［14］等人在研究秀麗野海棠葉片不定芽生根時，使用MS 培養(yǎng)基取得了良好的效果。崔旭東［10］發(fā)現(xiàn)渤豐1 號楊在1/2MS的培養(yǎng)基中生根效果最好。任如意［15］使用1/4MS培養(yǎng)基培養(yǎng)藥用植物北玄參，生根率達100%，平均生根數(shù)為11.33。不過，崔莉潔［13］等人比較歐洲黑楊在1/2MS 與MS 培養(yǎng)基上的生根效果，結果表明1/2MS 培養(yǎng)基生根效率和效果明顯優(yōu)于MS 培養(yǎng)基。金華等［16］人利用741 楊的培養(yǎng)結果支持上述觀點。

本研究采用無機離子減半的1/2MS 培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，不定芽8 d 即可生根，生根率可達93.33%。由此可見，采用無機離子減半的1/2MS培養(yǎng)基更有利于歐洲黑楊生根。再生體系是遺傳轉化的基礎，而遺傳轉化是培育轉基因新品種的有效途徑。本研究建立了歐洲黑楊N46 無性系的組培再生體系，為黑楊快速無性繁殖及遺傳轉化提供了借鑒。

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