羅朝兵 鞠丹 劉中帥 張凌云

(省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室(北京林業(yè)大學)，北京，100083)

責任編輯:潘 華。

親環(huán)素是一類能與環(huán)孢霉素特異結(jié)合的蛋白家族，廣泛存在于生物體中，具有肽基脯氨酸順反異構酶活性，參與蛋白的修飾、折疊等過程［1］。早在1984年，親環(huán)素A 就已經(jīng)在生物體中發(fā)現(xiàn)并純化［2］，且已證明其在動物體內(nèi)病毒感染進程起到重要的調(diào)節(jié)作用［3］。近年來在植物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)親環(huán)素的存在。植物體親環(huán)素基因具有一般親環(huán)素的功能外，還參與植物生長發(fā)育、光合作用及脅迫應答等過程。例如，有研究表明擬南芥CYP38 在光系統(tǒng)II(PSII)復合體的裝配過程和維持其穩(wěn)定性起到重要的作用，突變體植株矮小且對高光超敏，植物因PSII受損而無法正常合成光和產(chǎn)物，進而影響植株的生長發(fā)育［4］;擬南芥CYP71 則通過與組蛋白H3 互作，且參與H3K27 的甲基化進程，cyp71 突變植株發(fā)育不正常，出現(xiàn)頂端分生組織發(fā)育受阻，根系生長減緩等［5］;擬南芥CYP59 是具有多結(jié)構域的親環(huán)蛋白，能與RNA 聚合酶II 最大亞基的C 端互作，進而參與轉(zhuǎn)錄的進程［6］。目前，Trivedi［7］等鑒定了35 個擬南芥親環(huán)素基因，28 個水稻親環(huán)素基因，并發(fā)現(xiàn)其在多種逆境條件下響應。越來越多的證據(jù)表明親環(huán)素蛋白在植物的生長發(fā)育及形態(tài)建成、逆境生理、mRNA 進程、蛋白降解與信號轉(zhuǎn)導中起到重要作用，但人們對親環(huán)素的功能依然知之甚少，且目前研究材料僅限于模式植物和部分作物，關于木本植物中親環(huán)素特性及功能尚未見報道。

青杄(Picea wilsonii.Mast)屬于松科(Pinaceae)云杉屬(Picea)植物，是一種耐寒冷、耐旱的多年生木本針葉植物，廣泛分布于亞熱帶和溫帶地區(qū)，是我國重要的經(jīng)濟林植物［8］。本研究從青杄中克隆得到一個CYP 基因(命名為PwCYP1)，通過RACE PCR 得到其全長cDNA 序列。利用qRT-PCR 等技術分析了其在不同組織及發(fā)育時期的表達量及對各種逆境的響應。本研究將對CYP 基因家族的功能研究、特別是其生殖生長的機制研究提供理論基礎，也為篩選優(yōu)質(zhì)林木抗性基因提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材與試劑

多年生青杄(Picea wilsonii)種子和花粉均采集于中國科學院北京植物園，組織特異性表達試驗使用3a 苗齡青杄幼苗。青杄cDNA 文庫由英濰捷基公司利用Gateway 技術構建完成［9-10］。激素和逆境處理試驗使用8 周苗齡青杄幼苗。青杄幼苗培養(yǎng)于25 ℃室溫，空氣濕度50%，光周期為16 h 光照，8 h黑暗的溫室，培養(yǎng)基質(zhì)為V(營養(yǎng)土)∶ V(蛭石)=1∶1 混合，每周使用自來水充分澆灌1 次。植物材料經(jīng)處理后液氮速凍于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

青杄cDNA 文庫載體為pDONR222，由Invitrogen 公司提供。克隆載體為pEASY- T1，購買自Transgene 公司。RNA 提取試劑盒(TRI pure Reagent)購買于AidLab 公司，PCR Taq Mix、DNA Maker(DL2000，DL15000)、熒光定量PCR 試劑盒(SYBR Green SuperReal Premix)購買于天根公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)購買于Fermentas 公司。所用激素購買于Sigma 公司。其他試劑購買于AMRESCO 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RACE PCR 獲取目的基因PwCYP1 的全長

利用青杄cDNA 文庫為模板，根據(jù)PwCYP1 的EST 序列與pDONR222 載體的序列設計引物，進行RACE PCR。使用引物5-race-F 與5-race-R擴增5’方向序列，使用3-race-F 與3-race-R擴增出3’方向的序列。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、連接pEASY-T1、測序后獲得PwCYP1 的末端序列，與EST 序列拼接后獲得PwCYP1 的全長cDNA 序列。設計引物CYP-F 與CYP-R，經(jīng)過PCR后得到開放閱讀框完整的核酸序列，連接到pEASY-T1 上，獲得PwCYP1 單克隆。所用到的引物見表1。

表1 PwCYP1 克隆及組織表達分析所需要的引物

1.2.2 生物信息學分析

根據(jù)PwCYP1 的全長序列，利用DNAMAN 推導出PwCYP1 的編碼框確定其蛋白氨基酸的序列，蛋白多序列比對運用clustalx 軟件和Espript(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)，系統(tǒng)樹的構建利用MEGA5 軟件，構樹方法為鄰位相連法(Neighbor-joining)，bootstap 檢測為1 000 次。利用Expasy(www.expasy.org)中的Compute pI/Mw 工具來計算蛋白的理論等電點與分子量;利用ProtScale 工具(http://web.expasy.org/protscale/)進行疏水性分析;利用ScanProsite(http://prosite.expasy.org/)對目的基因的結(jié)構域進行預測;利用GOR4(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)進行蛋白的二級結(jié)構預測;利用SWISS-MODLE(http://swissmodel.expasy.org/)進行蛋白的三級結(jié)構預測。

1.2.3 組織特異表達試驗

用于試驗的3年生青杄的根、莖、針葉及青杄種子及花粉總RNA 的提取利用AidLab 公司的植物RNA 提取試劑盒。RNA 提取后經(jīng)過電泳和分光光度法檢測均達到要求，運用Fermentas 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒。均一化濃度之后在StepOnePlus Real Time RT-PCR 儀器上進行qRT-PCR 來檢測基因在不同組織的相對表達量，所用特異引物為CYP-RT-F 與CYP-RT-R，內(nèi)參基因為青杄延伸因子蛋白EF-1α［11］，引物為EF-1α-F 與EF-1α-R(表1)。試驗進行3 次重復。

1.2.4 逆境與激素響應試驗

逆境與激素響應試驗參考［12-13］方法，并將處理的激素處理時間和濃度加以調(diào)整。具體處理方法如下:將8 周苗齡的青杄幼苗根浸入激素溶液分別處理3、6 和12 h，以水為對照。試驗中使用的激素包括ABA、吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)、GA、MeJA、水楊酸(Salicylic Acid，SA)和油菜素內(nèi)酯(brassinolide，BR)，濃度均為100 nmol·L-1。干旱試驗中，將8 周苗齡的青杄幼苗置于溫室中無水培養(yǎng)4周，對照組正常培養(yǎng);鹽脅迫試驗中，實驗組每天分別噴施5 mL 2%、4%、6%的NaCl 溶液，處理4 周，對照組用清水處理。將8 周苗齡的青杄幼苗放于清水中，分別放置于45、4 ℃環(huán)境中，對照組置于室溫條件，分別處理0、0.5、1、3、6、12 h 后，取樣后液氮速凍置于-80 ℃?zhèn)溆?。機械損傷響應試驗中，用鑷子將8 周苗齡青杄幼苗的葉片損傷后，分別于0，0.5，1，2，3 h 取樣，對照組正常培養(yǎng)。過氧化氫(H2O2)響應試驗中，將8周苗齡青杄幼苗放置于5% H2O2溶液中，分別于0，1，3，6 和12 h 取樣。分別提取青杄幼苗和各組織總RNA 后進行反轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR 等試驗檢測各組織PwCYP1 的表達量變化。試驗進行3 次重復。

1.2.5 種子萌發(fā)試驗

種子萌發(fā)試驗采用水培法［14］。將吸水濾紙鋪在培養(yǎng)皿中，將春化1 個月的青杄種子分散放入濕潤的濾紙上培養(yǎng)，保持濾紙濕潤，在室溫條件(25℃)下進行萌發(fā)試驗。將培養(yǎng)皿置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中，光周期為16 h 光照/8 h 黑暗，培養(yǎng)12 d，分別在培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12 d 時采樣，液氮速凍后置于-80 ℃保存，用于PwCYP1 基因在種子不同萌發(fā)時期表達量分析。所有試驗進行3 次重復。

1.2.6 花粉萌發(fā)試驗

花粉萌發(fā)試驗參照［11］方法:將保存于-80 ℃的青杄花粉取出，放在-20 ℃中24 h，再放于4 ℃中2 h 以復蘇其活力后進行萌發(fā)試驗?；ǚ鄣囊后w培養(yǎng)基由12%蔗糖、0.01%硼酸、0.03%硝酸鈣與5 mmol·L-1檸檬酸-磷酸緩沖液組成(pH=5.8)。取花粉置于培養(yǎng)基中200 r/min，28 ℃搖床中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、2、6、12、18、24、30、36 h 后取樣，液氮速凍置于-80 ℃保存，用于檢測PwCYP1 表達量。進行3 次重復試驗。

1.2.7 缺素處理試驗

將正常生長條件下的3年生青杄幼苗移至不含有機物料的土壤中，正常澆水4 周，直到青杄幼苗嚴重枯萎，頂芽不能繼續(xù)生長。對照植株正常培養(yǎng)。提取RNA，檢測PwCYP1 表達量。進行3 次重復試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 PwCYP1 的cDNA 克隆

利用青杄cDNA 文庫為模板，根據(jù)PwCYP1(登錄號為KT210442)的EST 序列與pDONR222 載體的序列設計引物，進行RACE PCR。PwCYP1 全長cDNA 為962 bp，編碼框為516 bp 組成，編碼一個171氨基酸的多肽，Protparam 工具預測蛋白的分子量約為17.98 kDa，理論等點為8.34。分子式為C799H1248N216O238S9，甘氨酸(Gly)量最多為15.8%，纈氨酸(Val)為11.1%，賴氨酸量為7.6%。蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為15.71，表明蛋白比較穩(wěn)定。

2.2 多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

運用NCBI 的BLAST 工具檢索PwCYP1 的同源基因，發(fā)現(xiàn)綠豆(Vigna radiate)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、火炬松(Pinus taeda)、蓖麻(Ricinus communis)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)等物種中的同源基因，利用ClustalX 軟件對PwCYP1 及其同源基因進行多序列比對，結(jié)合軟件Mega5.0 構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn):火炬松(Pinus taeda)的一個基因(登錄號EF532602)與PwCYP1 高度同源，被歸為一簇(圖1)。多序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CYP 蛋白在不同物種間有非常高的相似性(圖2)。

圖1 青杄PwCYP1 進化樹分析

圖2 不同物種CYP 蛋白多序列比對

2.3 二級結(jié)構和三級結(jié)構預測

運用GOR4 工具預測PwCYP1 的二級結(jié)構，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白主要有α-螺旋(6.43%)、延伸鏈結(jié)構(33.33%)與無規(guī)則卷曲(60.23%)組成。運用SWISS-MODEL 工具預測蛋白的三級結(jié)構，結(jié)果如圖3，可以預測為球狀蛋白，疏水位點與親水位點在蛋白表面均勻分布。

圖3 PwCYP1 二級結(jié)構和三級結(jié)構

2.4 PwCYP1 的表達分析

2.4.1 PwCYP1 的組織表達特異性分析

通過半定量RT-PCR 與qRT-PCR 試驗檢測PwCYP1 在青杄各組織的表達模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PwCYP1 在青杄的各組織中均有表達，但在花粉中表達量最高(表2)。

表2 PwCYP1 在青杄各組中的相對表達量

2.4.2 PwCYP1 在青杄種子萌發(fā)過程中的表達

通過qRT-PCR 檢測PwCYP1 在青杄種子萌發(fā)過程中表達模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PwCYP1 在青杄種子萌發(fā)過程中表達量呈下降趨勢，在第4 天的時候降到最低值后表達量略有上升，并在第6 天之后表達量維持在相對穩(wěn)定數(shù)值(表3)。

表3 PwCYP1 在種子萌發(fā)不同時期的相對表達量

2.4.3 PwCYP1 花粉不同發(fā)育時期的表達分析

在組織特異表達試驗中已發(fā)現(xiàn)PwCYP1 在花粉中的表達量最高，因此利用qRT-PCR 方法檢測在花粉萌發(fā)后不同時期的相對表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青杄花粉在萌發(fā)的0～24 h 階段PwCYP1 表達量逐漸減低，在24 h 達到最低值后被上調(diào)至相對穩(wěn)定值(表4)。

2.4.4 PwCYP1 對逆境的響應

分別提取干旱處理4 周后青杄幼苗的根、莖、針葉RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 進行qRT-PCR，結(jié)果表明，經(jīng)過干旱處理后根中PwCYP1 的表達量較對照上升4 倍左右，莖中PwCYP1 的表達量上升2.5 倍，針葉中表達量變化不明顯(表5);經(jīng)過2% NaCl 處理后根中PwCYP1 的表達量上升70 倍左右，莖中PwCYP1 的表達量上升100 倍，針葉中表達量上升7 倍左右，但隨著NaCl 濃度的上升，PwCYP1 的表達量呈下降趨勢(表5);經(jīng)過45 ℃處理后PwCYP1 的表達量在0.5～1 h 內(nèi)先上升后下降，1～3 h 內(nèi)又上升，3～12 h 呈逐漸下降的趨勢(表6);機械損傷處理后PwCYP1 的表達量先上升，1 h 上升至2.5 倍達到最大值后表達量被下調(diào)至一穩(wěn)定值(表7);H2O2處理后，PwCYP1 的表達量在0～1 h 內(nèi)上升，1～12 h 內(nèi)下降，但變化不明顯(表8);冷(4 ℃)處理后3 h，PwCYP1 的表達量被抑制降低到0.4 倍，3 h 后表達量被上調(diào)(表9)。

表4 PwCYP1 在花粉不同時期的相對表達量

表5 PwCYP1 在鹽、干旱處理下的表達模式

表6 PwCYP1 在熱激(45 ℃)處理下的表達模式

表7 PwCYP1 在機械損傷處理下的表達模式

表8 PwCYP1 在H2O2 處理下的表達模式

表9 PwCYP1 在冷(4 ℃)處理下的表達模式

2.4.5 PwCYP1 對缺素以及不同外源激素處理的響應

經(jīng)過缺素處理4 周后的3年生青杄幼苗，分別提取根、莖、葉RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 進行qRT-PCR。結(jié)果表明缺素處理后PwCYP1 在根、莖、針葉中的表達量均下降，且在根中表達量下降7 倍左右，莖和針葉中均下降2 倍(表10)。不同外源激素處理結(jié)果顯示，ABA，IAA，MeJA，SA 處理3 h 后PwCYP1 的表達量上升到最大值，而在3～12 h 內(nèi)，PwCYP1 的表達量被抑制;GA 處理后前期PwCYP1 的表達量變化不明顯，到12 h 時大幅度提高;BR 處理后6 h 后PwCYP1 的表達量升高，到12 h 時PwCYP1 的表達量重新下調(diào)(表11)。

表10 PwCYP1 在缺素處理下的表達模式

表11 PwCYP1 在激素處理下的表達模式

3 結(jié)論與討論

本研究從青杄的cDNA 文庫中克隆得到親環(huán)素基因PwCYP1，經(jīng)過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)PwCYP1編碼了一個包含171 個氨基酸的蛋白，分子量約為17.98 KDa，包含多個α-螺旋。多序列比對以及構建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示PwCYP1 和PtCYP1 聚為一簇。由于青杄(Picea wilsonii)和火炬松(Pinus taeda)都屬于松科，親緣關系相對比較近，且兩者在形態(tài)學上也具有非常高的相似性，推測兩物種在進化上有相同的祖先。

以為的研究中證實植物類親環(huán)素在植物生物學、脅迫應答等過程發(fā)揮作用。例如，Sekhar［15］等在木豆中分離得到一個親環(huán)素基因CcCYP，轉(zhuǎn)基因過表達于擬南芥中發(fā)現(xiàn)能增強多種逆境脅迫的抵御能力;Kim［16］等研究發(fā)現(xiàn)過表達水稻親環(huán)素基因OsCYP20-2 于擬南芥和煙草中增強了轉(zhuǎn)基因植株抵抗非生物逆境脅迫的能力。本研究中，PwCYP1在干旱和NaCl 處理后，根和莖中表達量均大幅度升高，尤其是2%的NaCl 處理后，PwCYP1 在根和莖表達量分別上升70 倍和100 倍。顯示PwCYP1 參與了青杄干旱和鹽脅迫應答。不同激素處理后PwCYP1 表達量也表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)。其中，ABA和MeJA 處理3 h 后PwCYP1 的表達量達到最高，機械損傷1 h 后表達量達到最大值，表明PwCYP1 能響應ABA 并參與了MeJA 誘導的機械損傷應答。Berardini 等發(fā)現(xiàn)擬南芥CYP40 不但對的營養(yǎng)生長有重要的調(diào)控作用［17］，同時能與熱激蛋白HSP90互作［18］。在本試驗中，我們對青杄幼苗進行45 ℃處理后，PwCYP1 表達量發(fā)生明顯變化，預示著Pw-CYP1 可能也參與了熱激反應。

已有研究表明親環(huán)素蛋白在植物各個器官都有表達，并發(fā)揮著重要的作用。Lippuner［20］等在擬南芥中發(fā)現(xiàn)ROC1 與ROC4 編碼兩個親環(huán)素蛋白，其中ROC1 在擬南芥各個器官都有表達，而ROC4 只在能進行光和作用器官表達;Romano［21］等在2004年在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)29 種親環(huán)素蛋白，普遍在各個組織和器官中表達，參與了光合作用［22］、生物脅迫響應［23］、花粉萌發(fā)［24］等一系列生理過程。Saito［25］等發(fā)現(xiàn)AtCYP1 主要在維管束與花中表達，AtCYP2主要在幼葉中表達，顯示了CYP 基因家族功能上的多樣性。本研究中，在青杄組織特異表達實驗中，PwCYP1 在各個組織均有表達，但在成熟花粉中表達量最高，進一步試驗證實在花粉萌發(fā)過程中PwCYP1 的表達量逐步下降，在花粉管生長后期其表達量維持在一定水平。相對于花粉中，雖然種子中表達量不高，但在種子萌發(fā)過程中PwCYP1 表達量呈現(xiàn)同花粉萌發(fā)過程中相似的變化趨勢，這些結(jié)果表明PwCYP1 參與了青杄花粉管生長和種子萌發(fā)過程，隨著花粉和種子萌發(fā)其表達量下降。

綜上所述，青杄PwCYP1 可能參與了青杄種子萌發(fā)、花粉萌發(fā)等多種生理過程，并參與ABA，Me-JA，IAA 等激素應答途徑，是一個具有抗旱、抗鹽、抗熱等潛在能力的抗逆基因。今后可以將該基因轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥或其他經(jīng)濟植物，進一步研究其抗逆功能，并探索其在植物中的抗逆機制。本研究將為植物親環(huán)素蛋白的進一步功能研究奠定基礎，也為未來篩選優(yōu)良林木基因提供理論依據(jù)。

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