黃真池 彭信海 歐陽樂軍

(嶺南師范學(xué)院，湛江，524048) (湖南省森林植物園) (嶺南師范學(xué)院)

責(zé)任編輯:潘 華。

桉樹原產(chǎn)澳大利亞，是桃金娘科(Myrtaceae)杯果木屬(Angophora)、傘房屬(Corymbia)和桉屬(Eucalyptus)植物的統(tǒng)稱，有1 039 個種、亞種和變種［1］。桉樹具有生長速度快、輪伐期短、耐干旱、耐瘦瘠等諸多優(yōu)點，是世界公認的三大人工林樹種之一［2］。據(jù)統(tǒng)計，全世界桉樹人工林面積超過2 000 萬hm2［3］。由于桉樹紙漿得率高，品質(zhì)好，經(jīng)濟效益顯著，其栽種范圍在不斷北移［4］。隨著栽種地的不斷北移，桉樹生產(chǎn)面臨低溫逆境的巨大威脅，極端低溫凍害甚至?xí)?dǎo)致其大面積死亡［5］。

低溫條件下，植物的生物膜結(jié)構(gòu)、可溶性糖含量、激素含量、蛋白質(zhì)組成、基因表達等都會發(fā)生改變［6］，并且低溫可引起ROS(reactive oxygen species)積累，使蛋白質(zhì)、DNA 和脂質(zhì)受損，導(dǎo)致細胞損傷［7］。植物細胞中ROS 的代謝平衡影響到分裂、分化、發(fā)育、抗逆等細胞代謝的多個過程［8］。過氧化物酶類(E.C.1.11.1.x)催化以過氧化物為電子受體的氧化還原反應(yīng)。目前把過氧化物酶劃分為從EC1.11.1.1 到EC1.11.1.16(其中EC1.11.1.4 類被劃出)的15 小類［9］。

過氧化物酶類中，NADPH 氧化酶由rboh(respiratory burst oxidase homologue)基因編碼，定位在細胞質(zhì)膜上［10］，通過將電子傳遞給O2生成超氧陰離子，后者很快生成過氧化氫、羥自由基等活性氧分子，是產(chǎn)生ROS 的主要位點［11］。在受到外來信號的刺激時，該酶能通過自身的激活或失活迅速引起ROS 的升高或降低，進而在植物生長發(fā)育及應(yīng)答生物或非生物脅迫中發(fā)揮重要作用［12］。低溫可以誘導(dǎo)葡萄NADPH 氧化酶活性升高，引起H2O2含量升高。H2O2作為信號分子可激活水稻應(yīng)答低溫脅迫早期的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，提高水稻增強對低溫脅迫抗性［13］。

抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase APX)，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase GPX)，過氧化物酶(Class III plant Peroxidases POX)等在清除ROS，維持植物細胞ROS 的平衡過程中發(fā)揮著重要作用［14-15］。APX 以抗壞血酸為電子供體，將H2O2分解成H2O 和O2。APX 的同工酶在細胞中有明顯的定位，分布在葉綠體、線粒體、過氧化物體和胞質(zhì)溶膠等亞細胞組分中。植物細胞發(fā)育過程、生物或非生物逆境等調(diào)節(jié)APX 的表達［16］。低溫貯藏的馬鈴薯塊莖胞質(zhì)中的APX mRNA 含量較常溫貯藏下明顯增多［17］。過表達APX 和CuZnSOD的地瓜對低溫逆境的耐受力明顯增強［18］。Sato et al.［19］報道，穎花發(fā)育初期過表達APX1 基因的水稻，低溫脅迫下可維持其高水平的APX 活性，并提高水稻在孕穗的耐寒性。曾秀存等［20］報道，白菜型冬油菜的APX 活性越高植株的抗寒性越強。

GPX 是植物細胞中清除ROS 的關(guān)鍵酶類，以谷胱甘肽為電子供體，將H2O2、有機氫過氧化物或脂質(zhì)過氧化物等分解成H2O 和O2［21］，保護細胞膜免受氧化損傷［22］。GPX 定位于胞質(zhì)、葉綠體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，多種非生物逆境都可顯著增強擬南芥各種組織中AtGPX6 表達［23］。LePHGPX 的瞬時表達可保護煙草免遭鹽脅迫和高溫的傷害，同時穩(wěn)定表達的LePHGPX 可增強煙草對灰霉菌的抗性［24］。在冷脅迫或外源H2O2作用下，水稻GPX 的表達上調(diào)。水稻線粒體OsGPX3 的沉默會導(dǎo)致水稻線粒體中H2O2大量積累、并抑制根的伸長生長［25］。與耐寒性較差的品系相比，冷脅迫下耐寒性較強水稻的懸浮細胞的GPX 活性明顯增強［26］。

POX 有2 種完全相反的功能。在peroxidative cycle 中POX 利用酚類、木質(zhì)素前體、生長素或次生代謝物質(zhì)提供的電子將H2O2分解成H2O 和O2［27］;而在hydroxylic cycle 中，POX 能催化以超氧陰離子為主的多種ROS 的形成［28］。POX 功能復(fù)雜，在植物生長發(fā)育各時期的多個代謝途徑中發(fā)揮作用，如細胞壁代謝、傷口愈合、生長素代謝［29］、花青素的積累等［30］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，冷脅迫下，馬鈴薯POX 的表達上調(diào)［31］。辣椒CaPO2 基因在寒冷、干旱、高鹽等逆境誘導(dǎo)下表達升高，增強了辣椒對逆境和炭疽病的抗性［32］。麻風(fēng)樹幼苗在短期的抗寒鍛煉過程中POX 活性顯著升高，增強了對冷脅迫的耐受力［33］。

目前，研究植物耐寒性與過氧化物酶關(guān)系常用水稻、擬南芥等草本植物為材料［16-32］，以木本植物作材料的報道很少［33-35］，以桉樹為材料的此類研究鮮有報道。Fawal 等［36］建立的The PeroxiBase(http://peroxibase.toulouse.inra.fr/)為研究過氧化物酶的功能和代謝奠定了基礎(chǔ)。本研究參考The PeroxiBase 數(shù)據(jù)庫中4 類巨桉過氧化物酶基因的序列，分析了3 種耐寒性不同桉樹5 ℃冷處理24 h 后，rboh、APX、GPX、POX 4 類共16 種過氧化物酶基因的轉(zhuǎn)錄變化。本研究可為桉樹ROS 代謝和耐寒機理的研究及耐寒桉樹育種提供參考。

1 材料與方法

韋鄧桉(E.wetarensis ×E.dunnii)、鄧恩桉(E.dunnii)和湘鄧桉(E.dunnii xiangdeng)的半年苗齡樹苗，由湖南省森林植物園提供。耐寒性由弱到強順序:韋鄧桉、鄧恩桉、湘鄧桉。

取大小一致、長勢良好的3 種桉樹樹苗置于16 h 光/8 h 暗光周期，光照強度為365 lx 的人工氣候箱中，(5 ±1)℃冷處理24 h。對照組溫度為(26 ±2)℃，其他條件與處理組相同。

用打孔器取約50 mg 新鮮葉片于液氮中研磨成粉。先用1 mL RNAiso-mate for Plant Tissue 處理，再按RNAiso Plus 試劑的操作手冊步驟提取總RNA，溶于30 μL RNAase-free H2O。用Nanodrop 2000c 和1.2%瓊脂糖電泳檢測總RNA 質(zhì)量和濃度。在10 μL 反應(yīng)體系中分別加入5 ×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL 和總RNA 1 μg，用RNAase-free H2O 補齊至10 μL 后瞬時離心混勻，30 ℃反應(yīng)5 min 以去除總RNA 中殘存的基因組DNA。再在上述反應(yīng)體系中依次加入5 × Prime-Script Buffer 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ1 μL，RT Prime Mix 1 μL 和RNAase-free H2O 4 μL，瞬時離心混勻，37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃5 s 使酶失活，所得產(chǎn)物為初始cDNA。用EASY Dilution(for Real Time PCR)將初始cDNA 稀釋1 倍用于后續(xù)qPCR(real-time quantitative PCR qPCR)的模板。上述所用試劑均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

目的基因選擇及引物設(shè)計:根據(jù)The PeroxiBase(http://peroxibase.toulouse.inra.fr/)數(shù)據(jù)庫中4 類巨桉過氧化物酶基因的序列，用primer3plus 軟件設(shè)計qPCR 引物。經(jīng)qPCR 預(yù)試驗從4 類過氧化物酶基因(rboh、APX、GPX、POX)中篩選出16 個(每類4個)擴增效率高、特異性好的基因作目的基因。按黃真池等［37］選擇RTEF 基因作內(nèi)參基因。目的基因編號和引物序列及內(nèi)參基因引物序列見表1。

表1 4 類16 種過氧化物酶基因的編號和引物序列及內(nèi)參基因的引物序列

qPCR 擴增:qPCR 反應(yīng)儀器為Chromo 4TM System(Bio- Rad)。qPCR 反應(yīng)體系25 μL，分別是SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(2 ×Conc)12.5 μL，10 μmol/L Primer F 和Primer R 各1 μL，ddH2O 8.5 μL，稀釋后的cDNA 模板2 μL。擴增程序:94 ℃9 s，58 ℃9 s，72 ℃15 s，延伸后熒光讀數(shù)，共40 個循環(huán)。從70～95 ℃，每升高1 ℃熒光讀數(shù)1 次，根據(jù)融鏈溫度檢測反應(yīng)的特異性。每個反應(yīng)3 次重復(fù)。用Opticon Monitor 3.1 軟件分析各基因的擴增效率、Ct值。設(shè)常溫下基因的表達量為1，采用相對定量的Pfaffl 法，計算各基因冷處理后的相對表達值。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷處理后不同耐寒桉樹rboh 基因的轉(zhuǎn)錄變化

冷處理后，3 種桉樹4 個rboh 基因的轉(zhuǎn)錄均發(fā)生了明顯的改變(表2)，各樹種間的轉(zhuǎn)錄變化有顯著差異(P ＜0.05)。冷處理后，除耐寒性最差的韋鄧桉的rboh1 和rboh3 基因的轉(zhuǎn)錄顯著增強外(相對表達量分別是常溫下的2.143 9 倍和1.418 2 倍)，3 個樹種rboh 基因的表達均被抑制(相對表達量＜1)。其中，rboh1 和rboh3 基因的相對表達量與3 種桉樹的耐寒性強弱呈顯著的負相關(guān)，rboh2 和rboh4 基因的相對表達量與3 種桉樹的耐寒性強弱呈正相關(guān)。

表2 冷處理后3 種桉樹葉組織4 個rboh 基因的表達變化

rboh 基因編碼產(chǎn)生超氧陰離子的NADPH 氧化酶。冷處理后，耐寒性最差的韋鄧桉的rboh1 和rboh3 基因的轉(zhuǎn)錄顯著增強，可能會使細胞中ROS的含量急劇上升，導(dǎo)致ROS 對細胞膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等的損傷，加速冷害的發(fā)生。低溫下，耐寒性較強的鄧恩桉和湘鄧桉的rboh 基因的表達均被抑制，阻止了ROS 的產(chǎn)生，緩解了ROS 傷害，對這兩個樹種抵抗冷脅迫有利。

2.2 冷處理后不同耐寒桉樹APX 基因的轉(zhuǎn)錄變化

冷處理后，3 種桉樹間的APX 基因轉(zhuǎn)錄變化存在顯著差異(P ＜0.05)(表3)。耐寒性最強的湘鄧桉的AP1 基因被冷誘導(dǎo)表達的效果最為明顯(相對表達量是常溫下的3.21 倍)。AP1、AP2、AP4 這3個基因冷脅迫下的相對表達量與樹種的抗寒性呈正相關(guān)關(guān)系。冷處理后，韋鄧桉、鄧恩桉和湘鄧桉AP3基因的相對表達量分別是1.510 9、1.007 3、0.696 7。說明低溫誘導(dǎo)了韋鄧桉AP3 基因的表達，對鄧恩桉和湘鄧桉AP3 基因的表達則不影響或起抑制作用。APX 在清除ROS，維持ROS 代謝平衡狀態(tài)過程中起關(guān)鍵作用。冷脅迫下，耐寒性較強的鄧恩桉和湘鄧桉APX 的表達升高，增強了細胞清除ROS 的效率，減輕了冷脅迫對植物組織的傷害。

表3 冷處理后3 種桉樹葉組織4 個APX 基因的表達變化

2.3 冷處理后不同耐寒桉樹GPX 基因的轉(zhuǎn)錄變化

除GP2 外，冷處理引起3 種桉樹的GPX 基因表達上調(diào)(表4)。其中上調(diào)幅度最大的是耐寒性最強的湘鄧桉的GP4 基因(相對表達量是常溫下的3.969 9 倍)。除GP1 外，冷脅迫下GP2、GP3、GP4的表達量均是湘鄧桉的最高，且與韋鄧桉和鄧恩桉間呈顯著性差異(P ＜0.05)。冷脅迫下，韋鄧桉GP1 基因的相對表達量為3.121 7，與鄧恩桉和湘鄧桉間呈顯著差異。GPX 是植物細胞中清除ROS 的關(guān)鍵酶類，定位于胞質(zhì)、葉綠體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位。冷脅迫下，耐寒性最強的湘鄧桉GPX 的總體表達水平最高，增強了逆境下細胞清除ROS 的能力，減緩了冷脅迫傷害。但就GP1 基因而言，耐寒性最弱的韋鄧桉的相對表達量卻為最高。這可能是GPX 在細胞中的定位不同，對冷脅迫的應(yīng)答機制不同。

表4 冷處理后3 種桉樹葉組織4 個GPX 基因的表達變化

2.4 冷處理后不同耐寒桉樹POX 基因的轉(zhuǎn)錄變化

冷脅迫下、3 種桉樹POX 同工酶的相對表達量變化差異顯著，耐寒性較強的鄧恩桉和湘鄧桉POX的上調(diào)幅度小于耐寒性較弱的韋鄧桉(表5)。除了韋鄧桉的PO1 基因及鄧恩桉和湘鄧桉的PO2 基因，冷處理引起3 種桉樹的POX 基因的表達上調(diào)。其中韋鄧桉的PO2、PO3 和PO4 的上調(diào)幅度最為顯著，分別為常溫下的3.567 5、4.564 0、4.936 0 倍。低溫處理后，耐寒性較強的鄧恩桉和湘鄧桉的PO2 基因表達受抑制(相對表達量分別為0.792 3 和0.528 3)。冷脅迫下，韋鄧桉的PO1 基因表達受抑制(相對表達量為0.509 5)，而鄧恩桉和湘鄧桉的PO1 基因增強，分別達到常溫下的1.535 6 倍和2.633 8倍。植物POX 由超大基因家族編碼，種類多樣，功能復(fù)雜［32，38］。表5結(jié)果表明，冷逆境下桉樹POX 的表達模式具多樣性和復(fù)雜性。

表5 冷處理后3 種桉樹葉組織4 個POX 基因的表達變化

3 結(jié)論與討論

隨著栽種范圍不斷北移，桉樹生產(chǎn)面臨低溫逆境的巨大威脅［4］。對桉樹耐寒機理的研究多集中在分析電導(dǎo)率、可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸、丙二醛、細胞膜脂肪酸、保護酶活性、光合性能等生理指標的變化［39-40］。Keller 等［41-42］分析了冷脅迫下岡尼桉的表達譜，并推測表達譜的改變增強了岡尼桉的解毒能力和對凍害的抵抗力。關(guān)于冷脅迫下桉樹過氧化物酶的表達變化的研究尚未見報道。

本研究分析了3 種不同耐寒性桉樹5 ℃冷處理24 h 后，rboh、APX、GPX、POX 4 類共16 種過氧化物酶基因的轉(zhuǎn)錄變化。冷脅迫下，韋鄧桉rboh1、rboh3、AP3、GP1、PO2、PO3 和PO4 等基因的相對表達量明顯增高，總體表現(xiàn)為產(chǎn)生ROS 的rboh 表達增強，清除ROS 的APX 和GPX 總體表現(xiàn)為表達受抑制。冷脅迫下，韋鄧桉POX 表達量增幅最大，但POX 的功能具有兩面性，既能在peroxidative cycle中將H2O2分解，又能在hydroxylic cycle 中催化多種ROS 的形成。冷脅迫下，湘鄧桉4 個rboh 基因的表達均被抑制，AP1、AP2、AP4 的表達增強，GP2、GP3、GP4 的表達增強，PO2 表達受抑制、PO1、PO2 和PO4 的相對表達倍數(shù)雖然增高，但不如韋鄧桉升高幅度大?？傮w表現(xiàn)為產(chǎn)生ROS 的rboh 類基因的表達受抑制，分解ROS 的APX 類和GPX 類基因的表達則顯著升高。顯而易見，耐寒桉樹產(chǎn)生ROS 的rboh 類基因的表達受抑制，分解ROS 的APX 類和GPX 類基因的表達顯著升高，基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)降低了低溫下細胞中的ROS 水平，減輕了ROS 傷害，增強了耐寒性。

有趣的是，冷脅迫下3 種桉樹4 類過氧化物酶的轉(zhuǎn)錄變化趨勢均不完全一致，說明過氧化物酶類基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方式的多樣性和復(fù)雜性。這種現(xiàn)象的發(fā)生可能與過氧化物酶同工酶在細胞中的定位和功能不同有關(guān)。將此類酶的同工酶在細胞中精確定位將推動其功能與作用機理的研究。本研究探討了不同耐寒性桉樹冷脅迫下rboh、APX、GPX、POX 4 類共16 種過氧化物酶基因的轉(zhuǎn)錄變化，發(fā)現(xiàn)AP1、GP3、GP4 等基因的誘導(dǎo)表達能增強桉樹的抗寒性，rboh1、rboh3、PO1 等基因的表達上調(diào)加劇冷脅迫下的ROS 傷害。本研究可為桉樹ROS 代謝和耐寒機理的研究及耐寒桉樹育種提供參考。

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