陳浩宇，王 楠，葉田田，王淑君

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

非包衣乙?；?乳球蛋白腸溶片的制備及處方優(yōu)化

陳浩宇，王 楠，葉田田，王淑君*

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

目的研究乙?；?乳球蛋白作為新型腸溶輔料的特性，制備乙?；?乳球蛋白為腸溶輔料的阿司匹林非包衣腸溶片，并對(duì)其進(jìn)行處方優(yōu)化。方法使用乙酸酐對(duì)β-乳球蛋白進(jìn)行乙?；男裕疾旄男院蟮摩?乳球蛋白在不同pH環(huán)境下的溶解度及穩(wěn)定性。以阿司匹林為模型藥物，乙酰化β-乳球蛋白為腸溶填充輔料制備非包衣腸溶片，并利用Box-Behnken法對(duì)非包衣腸溶片的處方和工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果乙?；男允功?乳球蛋白等電點(diǎn)向低pH端偏移，實(shí)現(xiàn)了乙?；?乳球蛋白在pH<5.2環(huán)境下溶解度的降低和穩(wěn)定性的提高，因此顯現(xiàn)出了一定的腸溶釋藥性能。對(duì)制備的阿司匹林非包衣腸溶片進(jìn)行處方及工藝優(yōu)化后，實(shí)現(xiàn)了藥物在酸性條件下2 h釋放量低于2%且在中性環(huán)境下45 min釋放量達(dá)到97%的腸溶釋放效果。結(jié)論經(jīng)乙?；男缘摩?乳球蛋白可作為一種新型的腸溶輔料應(yīng)用于非包衣腸溶片的制備，所制備的非包衣腸溶片具有良好的腸溶釋藥效果。

藥劑學(xué)；非包衣腸溶片；響應(yīng)曲面法；乙?；?乳球蛋白；體外釋放

生物可降解材料由于其自身具有生物相容性高、安全無毒等特點(diǎn)，在藥物制劑領(lǐng)域中表現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景，尤其是多糖類和蛋白類物質(zhì)作為天然的可降解高分子材料在藥物傳遞系統(tǒng)中有著廣泛的研究。但是天然蛋白類物質(zhì)由于自身結(jié)構(gòu)的原因通常功能性較差，必須對(duì)其進(jìn)行適度的改性以滿足功能要求。傳統(tǒng)的蛋白改性方法主要分為四類[1]：酶法、化學(xué)法、物理法和基因工程法。其中化學(xué)法是蛋白類物質(zhì)改性途徑中最為常用的方法；乙酰化法作為目前最常見的蛋白化學(xué)改性手段之一，有大量的研究和文獻(xiàn)表明經(jīng)乙酰化改性后的蛋白類物質(zhì)，其起泡性，乳化性、穩(wěn)定性均得到了一定程度的提高[2-3]。

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-lg)是牛乳乳清中的主要蛋白質(zhì)，其質(zhì)量約占總?cè)榍宓鞍踪|(zhì)量的50%及總?cè)榈鞍踪|(zhì)量的 12%。β-乳球蛋白作為乳清蛋白的主要成分，具有多樣的功能性，經(jīng)琥珀酰化改性后作為輔料用于非包衣腸溶片的制備已有文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]。本文作者選用了乙酸酐對(duì)β-乳球蛋白進(jìn)行化學(xué)改性研究，考察乙酰化改性對(duì)β-乳球蛋白在不同pH環(huán)境下的溶解度和穩(wěn)定性影響，并針對(duì)由乙酰化β-乳球蛋白為輔料制備的非包衣腸溶片進(jìn)行了處方和工藝優(yōu)化。

1 儀器與材料

UV-2000紫外-可見分光光度計(jì)（尤尼柯(上海)儀器有限公司），壓片機(jī)（上海靈峰機(jī)械制造有限公司）；ZRCD6-B 型藥物溶出度測(cè)定儀（上海黃海藥檢儀器廠）。

β-乳球蛋白(β-lg，含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90.0%，上海華壹生物科技有限公司），透析袋（截流相對(duì)分子質(zhì)量為1 000，上海斯百全化學(xué)有限公司），阿司匹林（aspirin，醫(yī)藥級(jí)，含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%，武漢宏信康精細(xì)化工有限公司），2，2'-聯(lián)喹啉-4，4'-二甲酸二鈉(bicinchoninic acid hydrate disodium salt，BCA，含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%，成都貝斯特試劑有限公司)，乙酸酐、磷酸二氫鈉等其他試劑（分析純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 乙?；?乳球蛋白的制備

取50 g β-乳球蛋白在40 ℃磁力攪拌條件下溶解于500 mL蒸餾水中，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的β-乳球蛋白溶液，取15 g乙酸酐在磁力攪拌條件下逐漸加入到蛋白溶液中，控制反應(yīng)溫度在40 ℃；反應(yīng)過程中以2 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值使其保持在8.0～ 8.5；反應(yīng)結(jié)束后，去離子水透析(4 ℃，24 h)，冷凍干燥即得[6]。

2.2 乙?；男詫?duì)β-乳球蛋白溶解性的影響

通過改良的氮溶解指數(shù)(nitrogen solubility index，NSI) 方法估算乙酰化改性對(duì)β-乳球蛋白在不同pH環(huán)境下溶解性的影響。在不同pH值的100 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液中加入過量的乙酰化β-乳球蛋白，室溫條件下靜置2 h后1 500 r·min-1離心10 min，取200 μL上清液與4 mL BCA試劑混合搖勻，37 ℃保溫30 min后冷卻至室溫，于562 nm處測(cè)定吸光度值。β-乳球蛋白溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線。NSI計(jì)算公式為：NSI=[w(ProtS)/w(ProtT)]×100%。其中：w(ProtS) 為上清液蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，w(ProtT)為未經(jīng)離心的標(biāo)準(zhǔn)蛋白分散液質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其數(shù)值為0.2%[7]。

從圖1可以看到，經(jīng)乙酰化改性后的β-乳球蛋白的溶解特性較未改性之前存在著明顯的差異。當(dāng)?shù)鞍姿幦芤旱膒H=pI時(shí)，蛋白具有最低的溶解度，β-乳球蛋白的等電點(diǎn)為5.2，經(jīng)乙?；男院蟮鞍椎入婞c(diǎn)向低pH端偏移至3.7，β-乳球蛋白在pH<5.2環(huán)境下的溶解度顯著降低。在pH>5.2環(huán)境中，經(jīng)乙?；男缘摩?乳球蛋白的溶解度則在一定程度上得到了提高。

Fig. 1 The effect of acetylation on the solubility of β-lactoglobulin圖1 改性反應(yīng)對(duì)蛋白溶解度的影響

2. 3 模擬胃腸液中乙?；?乳球蛋白片的穩(wěn)定性

將乙?；?乳球蛋白通過粉末直接壓片的方式制備片重為500 mg的空白蛋白片，同法制備β-乳球蛋白片作為對(duì)照樣品。將兩種蛋白片分別置于在1 000 mL模擬胃液(simulated gastric fluid，SGF)和模擬腸液(simulated intestinal fluid，SIF)中，設(shè)置介質(zhì)溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)取樣，同時(shí)補(bǔ)充相同體積的介質(zhì)。觀察片劑形態(tài)變化并使用紫外分光光度計(jì)在280 nm處檢測(cè)溶出介質(zhì)中的蛋白量，以此判斷蛋白片在不同介質(zhì)條件下的穩(wěn)定性。

經(jīng)觀察，乙?；?乳球蛋白片的片劑形態(tài)在模擬胃液環(huán)境中發(fā)生了顯著的變化，隨著測(cè)定時(shí)間的推移逐漸由片狀膨脹成為球狀，但在外觀上始終保持了較高的完整性；在模擬腸液中，酰化蛋白片則以較快的速度發(fā)生溶解，至70 min時(shí)片劑形態(tài)基本消失。

圖2a表明，乙?；?乳球蛋白片和β-乳球蛋白片在模擬胃液中具有明顯不同的穩(wěn)定性，β-乳球蛋白片在模擬胃液中2 h已基本溶解；乙?；鞍灼谀M胃液中則始終保持了較高的穩(wěn)定性，5 h后僅有占片劑總量質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.8%的乙酰β-乳球蛋白被模擬胃液溶解。圖2b表明，乙?；?乳球蛋白片和β-乳球蛋白片在模擬腸液中具有較為相似的穩(wěn)定性，檢測(cè)結(jié)果表明，乙?；?乳球蛋白片和β-乳球蛋白片分別在75 min和90 min時(shí)就已完全溶解。

Fig. 2 The effect of acetylation on the stability of β-lactoglobulin in SGF(a) and SIF(b)圖2 乙?；男詫?duì)蛋白在模擬胃液(a)和模擬腸液(b)中的穩(wěn)定性影響

2.4 阿司匹林非包衣腸溶片的制備和體外釋藥性能研究

以乙?；?乳球蛋白為輔料，采用粉末直接壓片的方法制備載藥量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的阿司匹林非包衣腸溶片。將阿司匹林和乙酰化β-乳球蛋白分別過250 μm篩后，取50 mg阿司匹林與450 mg乙?；?乳球蛋白混合均勻，13 mm沖直接壓片，壓力為0.6 MPa，得到片劑質(zhì)量為500 mg的載藥乙?；?乳球蛋白片；同法制備載藥β-乳球蛋白片作為對(duì)照。按《中華人民共和國藥典》2010版二部附錄XD，采用溶出度測(cè)定法第一法裝置考察載藥蛋白片的體外釋藥情況[8]。以0.1 mol·L-1鹽酸溶液750 mL為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，依法操作，2 h后加入37 ℃的0.2 mol·L-1磷酸鈉溶液250 mL，混勻，用2 mol·L-1鹽酸溶液或2 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為6.8，繼續(xù)溶出至完全。在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)取樣10 mL，同時(shí)補(bǔ)充相同體積的介質(zhì)，樣品溶液濾過后在265 nm處測(cè)定吸光度，按照如下公式計(jì)算藥物累積釋放度：Q=[(V×∑t-1n=1c+ ct×V0)/m]×100% 。其中：Q為藥物累積釋放度，V為取樣體積，V0為介質(zhì)體積，ct為各時(shí)間點(diǎn)實(shí)測(cè)濃度，m為制劑中主藥含量（mg）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由乙酰化β-乳球蛋白為輔料制備的載藥蛋白片初步具備腸溶釋放性能。圖3表明，載藥β-乳球蛋白片在酸中1 h藥物釋放量已接近100%，而載藥乙?；?乳球蛋白片在酸性介質(zhì)中2 h藥物釋放量?jī)H為6%，符合《中華人民共和國藥典》對(duì)阿司匹林腸溶片在酸性介質(zhì)中2 h釋放量不高于10%的要求；在溶出介質(zhì)被更換為pH值6.8的磷酸鹽緩沖液后，該片劑的釋放速度明顯加快，45 min后藥物累積釋放量為64%，略低于《中華人民共和國藥典》對(duì)阿司匹林腸溶片在pH值6.8磷酸鹽緩沖液中45 min釋放量不低于70%的要求。因此，考慮在進(jìn)一步的處方優(yōu)化過程中加入少量的崩解劑，使乙?；?乳球蛋白片具備更好的腸溶釋藥性能。

Fig. 3 Release profiles of protein tablets in 0.1 mol·L-1HCL-pH 6.8 PBS medium圖3 載藥蛋白片在0.1 mol·L-1鹽酸溶液-pH6.8磷酸鹽緩沖液中釋放曲線

2.5 非包衣腸溶片的處方和工藝優(yōu)化

2.5.1 處方及工藝設(shè)計(jì)

為進(jìn)一步優(yōu)化乙?；?乳球蛋白為輔料制備的非包衣腸溶片的腸溶釋藥效果，選取微晶纖維素（MCC）為崩解劑，采用主藥（阿司匹林）與崩解劑經(jīng)干法制粒后，外加乙?；鞍纵o料混合均勻壓片的方式制備非包衣腸溶片，保證藥物在酸中低釋放量的同時(shí)提高其在中性環(huán)境下的釋放速度。

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定影響藥物釋放的主要因素為乙?；鞍子昧?(X1)和崩解劑用量(X2)及制片壓力(X3)，其極值范圍分別為：X1(450～550 mg)、X2(25～75 mg)和X3(0.5～1.5 MPa)，采用判定公式：Y=100% -︱P1-0%︱-︱P2-100%︱（P1為藥物在0.1 mol·L-1鹽酸溶液中的累積釋放度、P2為藥物在pH值6.8磷酸鹽緩沖液中的累積釋放度）判斷實(shí)際釋放度與預(yù)期釋放度（藥物在0.1 mol·L-1鹽酸溶液中無釋放，在pH值6.8磷酸鹽緩沖液中100%釋放）的符合程度，計(jì)算響應(yīng)值Y。

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)的原理，每個(gè)因素設(shè)置上下限水平為X1(450～550 mg)、X2(25～75 mg)和X3(0.5 ～1.5 MPa)，各因素及其水平見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

Table 1 Independent variables and levels investigated in the BBD表1 響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)因素與水平表

Table 2 Factor levels and observed responses for BBD表2 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及效應(yīng)值

2.5.2 模型擬合

將所得數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行效應(yīng)面試驗(yàn)分析，以實(shí)際釋放量與預(yù)期釋放量的符合程度作為效應(yīng)值進(jìn)行方程擬合，經(jīng)軟件對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析后，發(fā)現(xiàn)用二次階多項(xiàng)式回歸較優(yōu)，得到以X1、X2、X3為自變量的二次回歸方程模型如下：

Y= -374.0 + 1.97X1-1.68X2+ 2.60X3+ 5.60 × 10-3X1X2-4.0×10-3X1X3+ 2.4×10-2X2X3-2.2×10-3X12-1.36×10-2X22-8.0×10-2X32(R2=0.963 2，P=0.000 3＜0.01)

上述方程的擬合度良好，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明多元線性模型可較好地描述各因素與指標(biāo)之間的定量關(guān)系，可以用此模型進(jìn)行處方分析和預(yù)測(cè)。

應(yīng)用Design-Expert 8.0.5軟件繪制各效應(yīng)對(duì)因素的效應(yīng)面圖和等高線圖，見圖4-6。

Fig. 4 Response surfaces (a) and 2D contour plot (b) with Argument X1 & X2圖4 X1與X2自變量的效應(yīng)面圖(a)和等高線圖(b)

Fig. 5 Response surfaces (a) and 2D contour plot (b) with Argument X1& X3圖5 X1與X3自變量的效應(yīng)面圖(a)和等高線圖

Fig. 6 Response surfaces (a) and 2D contour plot (b) with Argument X2& X3圖6 X2與X3自變量的效應(yīng)面圖(a)和等高線圖(b)

通過各主要因素的用量范圍和Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)緩釋片處方進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析結(jié)果，確定最佳處方為每片(550 mg)含主藥40 mg、乙?；鞍纵o料470 mg、崩解劑微晶纖維素40 mg，制片壓力為0.9 MPa。

2.5.3 處方優(yōu)化驗(yàn)證

在預(yù)測(cè)最優(yōu)處方的基礎(chǔ)上，進(jìn)行3批樣品放大實(shí)驗(yàn)，考察0.1 mol·L-1鹽酸溶液-pH值6.8磷酸鹽緩沖液中的釋放行為，結(jié)果見表3。

Table 3 The verification of the optimized formulation表3 優(yōu)化處方的驗(yàn)證

由表3可知，在優(yōu)化范圍內(nèi)，處方的理論值與實(shí)測(cè)值能夠很好的吻合，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。這表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，所選工藝條件具有較好的重現(xiàn)性。

3 討論與結(jié)論

a. 乙?；男允侄慰捎行У亟档挺?乳球蛋白在pH<5.2環(huán)境下的溶解度，提高其在模擬胃液環(huán)境中的穩(wěn)定性；在pH>5.2環(huán)境中，經(jīng)乙?；男缘摩?乳球蛋白的溶解性能較未改性之前有著明顯的提高。這是由于乙?；磻?yīng)向β-乳球蛋白引入了中性的乙酰基基團(tuán)，導(dǎo)致蛋白中可解離的陽離子基團(tuán)減少，β-乳球蛋白的等電點(diǎn)向低 pH端偏移，使其在酸性環(huán)境中的電荷密度和溶解度有了明顯的降低；在高于蛋白等電點(diǎn)區(qū)域，由于乙?；鶎?duì)蛋白質(zhì)分子中的氨基陽離子的封閉使得蛋白質(zhì)分子間的靜電作用減弱，降低了蛋白質(zhì)分子間的聚集作用，使其水溶性增大[6]。采用粉末直接壓片方式制備的非包衣腸溶片，雖然在酸性介質(zhì)中2 h釋放量符合藥典對(duì)阿司匹林腸溶片釋放度的相關(guān)規(guī)定，但是其在中性條件下的釋放量卻偏低，因此考慮向制劑中加入一定量的崩解劑以提高藥物在中性環(huán)境下的釋放速度。選取主藥與崩解劑干法制粒后外加?；鞍纵o料混合壓片的方式制備非包衣腸溶片，既減少了藥物在低 pH環(huán)境下與酸性介質(zhì)的接觸面積，保證了較低的藥物釋放量；同時(shí)在中性環(huán)境中，伴隨著乙?；?乳球蛋白的溶解，崩解劑的加入有效地加快了藥物的釋放速度。

b. 改性β-乳球蛋白的這一特性能夠有效地應(yīng)用于口服緩控釋給藥系統(tǒng)當(dāng)中，尤其是作為一種新型的輔料應(yīng)用于非包衣腸溶片的制備，極大地降低了制備腸溶片的工藝難度和時(shí)間成本。此外針對(duì)其改性后在胃液環(huán)境中較好的抗酸能力和穩(wěn)定性，其作為載體屏障在生物大分子類藥物口服給藥和結(jié)腸靶向給藥方面同樣具有廣闊的研究和應(yīng)用前景。

c. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)乙酰化改性后，β-乳球蛋白的等電點(diǎn)由5.2向低pH端偏移至3.7。乙?；男钥捎行У亟档挺?乳球蛋白在pH<5.2環(huán)境中的溶解度、提高在胃液環(huán)境下穩(wěn)定性，同時(shí)提高其在pH>5.2環(huán)境下的溶解度。此外通過乙酰化β-乳球蛋白與崩解劑的聯(lián)合應(yīng)用及Box-Behnken響應(yīng)曲面法對(duì)所制備的非包衣腸溶片的處方和工藝的優(yōu)化，在有效降低藥物在酸性條件下釋放量的同時(shí)顯著的提高了藥物在中性環(huán)境下的釋放速度，提高了制劑的腸溶釋藥性能。

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The preparation of uncoated enteric tablets with acetylated β-lactoglobulin as excipients and optimization of the prescription

CHEN Hao-yu, WANG Nan, YE Tian-tian, WANG Shu-jun*
（School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China）

ObjectiveThe acetylated β-lactoglobulin was studied for the application in the preparation of uncoated enteric tablet as a new excipient.MethodsThe solubility and stability of acetylated β-lactoglobulin at different pH were investigated. The aspirin uncoated enteric tablet was prepared with modified β-lactoglobulin and the formula was optimized by Box-Behnken method.Resultsthe isoelectric point and the solubility of β-lactoglobulin decreased with the modification, but the stability of protein was increased at pH<5.2. The uncoated enteric tablets with aspirin maintained the accumulated amount of drug released under 2% within 2 hours at acid pH while 97% drug released in 45 mins at intestinal pH after the optimization of the formulation.ConclusionThe β-lactoglobulin, with modification of acetylation and appropriate formula, was potentially applied in the preparation of uncoated enteric tablets.

pharmaceutics; uncoated enteric tablet; Box-Behnken; acetylated β-lactoglobulin; in vitro dissolution

R 94

：A

(本篇責(zé)任編輯：呂向一)

2014-10-09

陳浩宇（1987-），男(漢族)，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，E-mail 383015618@qq.com；＊通訊作者： 王淑君（1972-），女（漢族），遼寧沈陽人，博士，教授，主要從事藥物新劑型研究，Tel. 024-23986360，E-mail xiaohu6408-cn@sina.com。

(2015)03-0107-10

10.14146/j.cnki.cjp.2015.03.004