陳先鋒 周前進 王瑞娜 段維軍 苗 亮 陳 炯①

(1. 寧波大學海洋學院 寧波 315211; 2. 寧波檢驗檢疫科學技術(shù)研究院 寧波 315012)

扁滸苔(Ulva compressa)是屬于綠藻門、綠藻綱、石莼目、石莼科、石莼屬的一種大型藻類。石莼屬(Ulva)藻類呈全球性分布,常見于海洋環(huán)境,半咸水或江河水中也有分布,多生長于潮間帶的巖石上或石沼中,或泥沙灘的石礫上,在大型海藻的藻體和船舶外殼上也可附生。其中,扁滸苔(U. compressa)、滸苔(Ulva prolifera)、腸滸苔(Ulva intestinalis)等在我國的海洋野生植物中分布極為豐富,是重要的經(jīng)濟藻類,含有許多人體必需的營養(yǎng)成分,可食用,也具有重要的藥用價值(Hiqashi-Okajet al,1999; Ramanet al,2004; Mamathaet al,2007)。同時,扁滸苔、滸苔等石莼屬藻類也是引起綠潮災(zāi)害的主要生物種類(Duanet al,2012; Huoet al,2013; Liuet al,2013b; Smetaceket al,2013)。近幾年,在黃海、東海等沿海水域由石莼屬引發(fā)的綠潮災(zāi)害對當?shù)氐暮Ｑ笊鷳B(tài)系統(tǒng)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成了巨大危害(Yeet al,2011; Huoet al,2013; Liuet al,2013a,b)。

目前,石莼屬等綠潮藻類的鑒定仍以傳統(tǒng)的藻類培養(yǎng),形態(tài)學觀察為主(Culverhouseet al,1996)。該方法不僅操作繁瑣(需定期更換培養(yǎng)液)、培養(yǎng)周期過長(30d左右)、對培養(yǎng)條件(光照、溫度、光周期)和培養(yǎng)設(shè)施有一定的要求,而且對操作人員的專業(yè)要求高,并不適用于藻類的快速診斷和綠潮災(zāi)害的及時防治。而且,石莼屬藻類的形態(tài)、色澤,以及藻體大小等隨環(huán)境變化而呈現(xiàn)出差異; 不同種的石莼屬藻類也會因環(huán)境變化呈現(xiàn)出相似的形態(tài)特征(Reddyet al,1992; Haydenet al,2003)。這種種內(nèi)和種間的形態(tài)特征的交錯給依賴于形態(tài)學特征的物種鑒定和檢測帶來了很大的困難。正是由于基于形態(tài)學特征的鑒定方法的不足,直到 2003年根據(jù)分子證據(jù),才將原石莼屬和原滸苔屬合二為一,統(tǒng)一為石莼屬(Ulva)(Haydenet al,2003)。日趨嚴重的綠潮災(zāi)害迫使石莼屬藻類的相關(guān)檢測技術(shù)向著快速、特異、準確的方向發(fā)展。

基于核酸擴增的分子檢測技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、檢測時間短等優(yōu)點,其中,以聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)或分子探針技術(shù)為主要反應(yīng)原理的分子技術(shù)已應(yīng)用于藻類物種鑒定,尤其是微藻的快速鑒定和檢測(Coyneet al,2005;Goffrediet al,2006; Yuanet al,2012; Antonellaet al,2013; Dollet al,2014)。但由于這些方法對儀器設(shè)備的要求較高,工作環(huán)境嚴格,僅限于實驗室診斷。日本學者 Notomi等(2000)研發(fā)了一種基于核酸擴增的新型檢測技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loopmediated isothermal amplification,LAMP),該技術(shù)在具鏈置換活性的 Bst DNA聚合酶的作用下,利用6—8條特異性引物,在恒溫條件下可使核酸擴增達到109—1010個數(shù)量級(Notomiet al,2000)。LAMP反應(yīng)可在類似于水浴鍋等恒溫容器中完成,擺脫對于儀器和實驗場地的苛刻要求。但是,LAMP產(chǎn)物的檢測以瓊脂糖凝膠電泳方法或濁度檢測法為主,在此方面仍舊受到凝膠成像系統(tǒng)或濁度儀等設(shè)備的限制。而橫向流動試紙條(lateral flow dipstick,LFD)檢測結(jié)果可視,若將這兩中技術(shù)聯(lián)用,可極大程度上降低了檢測過程對儀器的依賴性。LAMP-LFD技術(shù)是將LAMP產(chǎn)物進行生物素(biotin)標記,標記產(chǎn)物與異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的特異性探針雜交,雜交結(jié)果利用橫向流動試紙條(lateral flow dipstick,LFD)檢測。而且探針的引入可有效避免常規(guī)核酸擴增技術(shù)(PCR等)引起的污染問題,使得檢測結(jié)果更加特異,在生物物種的實驗室診斷和現(xiàn)場檢測領(lǐng)域均體現(xiàn)出較好的應(yīng)用潛力(Nimitphaket al,2008; Puthamiboolet al,2009; Dinget al,2010;王瑞娜等,2014)。

本研究根據(jù)扁滸苔的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1-5.8SITS2)的序列保守區(qū)設(shè)計 3對引物和1條異硫氰酸熒光素標記的探針,經(jīng)條件優(yōu)化后,建立了扁滸苔LAMP-LFD檢測方法。

1 材料與方法

1.1 藻種分離株及培養(yǎng)

實驗所用微藻分離株(塔瑪亞歷山大藻、無紋環(huán)溝藻、東海原甲藻、錐狀斯克里普藻、赤潮異彎藻)由寧波大學海洋生物實驗室藻種室提供。實驗所用石莼屬綠藻經(jīng)由母藻細斷法進行分離(Hiraokaet al,1998),按 Duan等(2012)采用的方法于本實驗室培養(yǎng)、保存。具體所用藻類見表 1,其中,扁滸苔分離株55用于LAMP條件優(yōu)化、靈敏度分析等實驗。

表1 LAMP-LFD方法建立過程中使用的藻類分離株Tab.1 Algal species used in LAMP-LFD assay

1.2 藻類DNA的制備

各藻類分離株基因組DNA的提取參照植物組織基因組DNA提取試劑盒的步驟進行(Qiagen,Hilden,Germany)。獲取的基因組DNA經(jīng)Qubit 2.0 Fluorometer(Life Technologies,Carlsbad,USA)測定濃度后用作標準品,–30°C 貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 LAMP-LFD引物及探針的設(shè)計

針對 NCBI上公布的扁滸苔 ITS1-5.8-ITS2序列(GenBank登錄號: AF013982)設(shè)計3對引物,包括上游外引物UcoITS-F3、上游內(nèi)引物UcoITS-FIP、下游外引物 UcoITS-B3、下游內(nèi)引物 UcoITS-BIP,以及環(huán)引物UcoITS-LF和UcoITS-LB,用于LAMP(表2,圖1)。同時,基于該擴增區(qū)段設(shè)計1條DNA探針UcoITS-HP用于雜交實驗(表2,圖1)。其中,上游內(nèi)引物UcoITS-FIP的 5’端進行 biotin標記,UcoITS-HP的 5’端進行 FITC標記。另外,外引物UcoITS-F3和UcoITS-B3作為引物應(yīng)用于常規(guī)PCR擴增,擴增片段大小為333 bp。上述引物和探針由英維捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

表2 扁滸苔ITS1-5.8-ITS2基因的LAMP-LFD引物和探針序列Tab.2 The primers and DNA probe targeting ITS1-5.8S-ITS2 of U. compressa used in LAMP-LFD assay

圖1 扁滸苔rDNA ITS1-5.8S-ITS2基因序列的LAMP-LFD引物設(shè)計示意圖Fig.1 Design of primers and DNA probe targeting ITS1-5.8S-ITS2 of U. compressa used in LAMP-LFD assay UcoITS-LFc、UcoITS-B1c、UcoITS-B2c和 UcoITS-B3c分別是UcoITS-LF、UcoITS-B1、UcoITS-B2和UcoITS-B3的互補序列

1.4 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

LAMP的反應(yīng)體系為 25μL,具體組成參考 Ding等(2010),主要包括20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),6.5 mmol/L MgSO4,10 mmol/L KCl,10 mmol/L(NH4)2SO4,0.1% Triton X-100,1.6 mol/L甜菜堿,1.4 mmol/L dNTPs,外引物UcoITS-F3和UcoITS-B3各0.2μmol/L,內(nèi)引物 UcoITS-FIP和 UcoITS-BIP各 1.6μmol/L,環(huán)引物UcoITS-LF和UcoITS-LB各0.4μmol/L,Bst DNA聚合酶(New England BioLabs,美國)8 U,藻類基因組DNA標準品1μL。陰性對照不加任何DNA。選用扁滸苔分離株55的較高濃度的基因組DNA (1.0×103pg/μL)作為模板,分別在61、63和65°C下進行LAMP反應(yīng),根據(jù)擴增效果篩選最佳反應(yīng)溫度。將 DNA標準品已 10倍濃度為單位進行倍比稀釋,選取1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100、1.0×10–1和1.0×10–2pg/μL 等 6個濃度的基因組 DNA 為模板,在確定的最適溫度下進行 LAMP擴增,根據(jù)起峰時間和擴增強度分析反應(yīng)時間; 在此基礎(chǔ)上,選擇最低檢測濃度的基因組DNA為模板分別選擇20、30、40、50、60和70 min作為LAMP反應(yīng)時間,在最適溫度下擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠電泳分析,確定反應(yīng)的最適時間。

1.5 利用LFD檢測LAMP產(chǎn)物(LAMP-LFD)

LFD試紙條購買自 Milennia Biotec GmbH(Milenia GenLine HybriDetect by Milenia Biotec GmbH,Germany)。根據(jù)該試紙條的設(shè)計原理,檢測時FITC標記的探針與biotin標記的LAMP產(chǎn)物特異性雜交,雜交產(chǎn)物與金標記的 FITC抗體結(jié)合形成三元復(fù)合物,結(jié)合在具有 biotin抗體的檢測線上; 未雜交的探針與金標記的 FTIC抗體形成兩元復(fù)合物,經(jīng)過檢測線,結(jié)合在質(zhì)控線上。經(jīng)biotin標記的LAMP反應(yīng)結(jié)束后,不進行終止反應(yīng),而是將20 pmol FITC標記的探針 UcoITS-HP加入反應(yīng)體系中,63°C雜交 5 min。取5 μL雜交液加入 80 μL Buffer混勻,將試紙條沿正確方向豎直放入該Buffer中反應(yīng)3 min左右,肉眼判斷結(jié)果。

1.6 LAMP-LFD的特異性驗證

選擇扁滸苔(Ulva compressa)分離株 SDF10、曲滸苔(Ulva flexuosa) SDF12、Ulva ohnoiFJ4、緣管滸苔(Ulva linza) HS42、孔石莼(Ulva pertusa) SDF30、滸苔(Ulva prolifera) XS5等常見石莼屬綠藻,以及塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense) NMBjah048、無紋環(huán)溝藻(Gyrodinium instriatum) NMBjah046、東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense) NMBjah045、錐狀斯克里普藻(Scrippsiella trochoidea) NMBjah044和赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo) H1等國內(nèi)常見微藻種類共11株用于LAMP-LFD的特異性檢驗。上述藻類基因組DNA的提取方法按步驟1.2進行,將各基因組DNA的濃度調(diào)整到約1.0×103pg/μL后用作LAMP反應(yīng)的模板,反應(yīng)體系和條件參考步驟 1.4。擴增產(chǎn)物分別采用瓊脂糖凝膠電泳和LFD進行檢測。

1.7 LAMP-LFD的靈敏度分析

如步驟1.4所述,選取扁滸苔分離株55的6個不同濃度(1.0×103,1.0×102,1.0×101,1.0×100,1.0×10–1和1.0×10–2pg/μL)的基因組 DNA 為模板,采用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進行LAMP反應(yīng),擴增產(chǎn)物分別采用2%瓊脂糖凝膠電泳和LFD進行檢測。

同時,以上述6個不同濃度的基因組DNA為模板,以外引物UcoITS-F3和UcoITS-B3為特異性引物,進行 PCR擴增。PCR的反應(yīng)體系為 25 μL,包括:10×PCR Buffer 2.50 μL,5 U/μL rTaq DNA 聚合酶(TaKaRa,中國大連)0.25 μL,dNTPs (0.25mmol/L)2μL,0.20 μmol/L gyrB-F3 2 μL,0.20 μmol/L gyrB-B3 2 μL,模板1 μL,用無菌水補足反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序是: 95°C 預(yù)變性 2 min 后; 94°C 30 s,55°C 30 s,72°C 30 s,擴增 30 個循環(huán); 72 °C 延伸 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8 LAMP-LFD的重復(fù)性實驗

取3份新培養(yǎng)的扁滸苔分離株55,按照步驟1.2的方法進行基因組 DNA的提取,濃度測定后,調(diào)整至最低檢測濃度,采用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進行LAMP反應(yīng),擴增產(chǎn)物分別采用瓊脂糖凝膠電泳和 LFD進行檢測。

1.9 野外樣品檢測

共收集海水樣品12份。樣品通過100目的篩絹網(wǎng)過濾后,取400 mL水樣與500 mL的三角燒瓶中,按 Duan等(2012)所述的方法進行培養(yǎng),培養(yǎng)成熟的藻體用于顯微觀察。另取過濾后的水樣250 mL直接用于基因組DNA的提取,具體方法參考1.2所述,用于LAMP-LFD和PCR鑒定。

2 結(jié)果

2.1 LAMP擴增條件的確立

以較高濃度的扁滸苔基因組DNA(1.0×103pg/μL)為模板,分別在61、63和65°C下進行LAMP。3個反應(yīng)溫度下均可獲得特征性的梯形條帶,而不添加任何DNA模板的反應(yīng)管中未檢測到擴增(圖2a)。但在 63°C條件下,梯形條帶間的間隔最為分明,條帶最為清晰,故選擇63°C作為最適反應(yīng)溫度(圖2a)。

在 63°C 條件下,模板濃度在 1.0×103pg/μL 和1.0×100pg/μL之間均可獲得明顯擴增(圖2b),起峰時間維持在27—41 min (圖2c),起峰時間隨模板濃度降低而逐漸增加,呈明顯的線性相關(guān)(圖2c),約60 min時,相對熒光強度達到平臺期(圖 2b)。當以較低的1.0×100pg/μL的基因組DNA為模板時,發(fā)現(xiàn)反應(yīng)到50 min時可以檢測到明顯的梯形條帶,而70 min與60 min時的產(chǎn)物濃度并無明顯增加(圖2d),與擴增曲線顯示的結(jié)果(圖2c)一致。因此確定60 min為最適反應(yīng)時間。

2.2 LAMP-LFD檢測的特異性

以 11株常見石莼屬綠藻和微藻的基因組DNA(1.0×103pg/μL)為模板,按優(yōu)化的 LAMP 反應(yīng)體系63°C反應(yīng)60 min。結(jié)果表明,滸苔分離株SDF10與55一樣可獲得明顯的擴增(圖3a,3b),而曲滸苔、滸苔、緣管滸苔、孔石莼等石莼屬綠藻的反應(yīng)呈陰性(圖3a,3b),塔瑪亞歷山大藻、無紋環(huán)溝藻、東海原甲藻、錐狀斯克里普藻和赤潮異彎藻等5株微藻的反應(yīng)亦呈陰性(圖 3a,3b)。LFD檢測結(jié)果表明,以兩株扁滸苔分離株的基因組 DNA為模板時,試紙條的檢測線位置出現(xiàn)明顯的陽性條帶,而其它 10株藻類分離株的反應(yīng)產(chǎn)物在試紙條的檢測線位置未能檢測到條帶(圖 3c)。

2.3 LAMP-LFD檢測的靈敏度

結(jié)果表明,LAMP擴增過程中,通過凝膠電泳的方式可檢測到的最低模板濃度是 1.0×100pg/μL(圖4a),而利用 LFD 可檢測到的最低濃度是 1.0×10–1pg/μL (圖 4b)。以外引物 UcoITS-F3 和 UcoITS-B3 為特異性引物的 PCR方法能夠檢測到的最低模板濃度為 1.0×101pg/μL(圖 4c)。

圖2 LAMP檢測扁滸苔最適反應(yīng)條件的確定Fig.2 The optimization of LAMP for detection of U. compressaa. 確定最佳反應(yīng)溫度: 1、3和5,以蒸餾水為模板; 2、4和6,以扁滸苔分離株55的較高濃度基因組DNA(1.0×103 pg/μL)為模板; M,GeneRuler 100 bp plus DNA Ladder; 下同。b. 不同濃度的基因組DNA作為模板的LAMP反應(yīng); NC,不加任何DNA模板。c. 擴增的起始時間(起峰時間)與基因組DNA濃度的關(guān)系,呈明顯額線性相關(guān)。d. 以較低濃度(1.0×100 pg/μL)基因組DNA為模板時,擴增時間對LAMP產(chǎn)物的影響; NC,不加任何DNA模板

2.4 LAMP-LFD檢測的重復(fù)性

將3份新培養(yǎng)的扁滸苔分離株55的基因組DNA進行倍比稀釋,以1.0×100pg/μL濃度的基因組DNA為模板進行 LAMP反應(yīng),產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析; 以1.0×10–1pg/μL濃度的基因組DNA為模板進行LAMP反應(yīng),產(chǎn)物經(jīng)LFD檢測。實驗表明,利用扁滸苔的基因組DNA為模板進行的LAMP或LAMP-LFD檢測,結(jié)果均呈陽性; 而不加任何 DNA為模板的檢測,結(jié)果呈陰性,具有良好的重復(fù)性。

2.5 LAMP-LFD檢測海水中藻類樣品的適用性分析

利用傳統(tǒng)的藻類分離、培養(yǎng)、顯微觀察的方法對獲得的 12個海水樣品進行了鑒定,發(fā)現(xiàn)江蘇的JS-3-1、JS-10和 JS-11為扁滸苔(表 3)。LAMP-LFD的結(jié)果表明江蘇的JS-3-1、JS-10和JS-11檢測結(jié)果為陽性,其余為陰性,檢測結(jié)果與顯微觀察一致(表3)。利用PCR的方法獲得江蘇的JS-3-1、JS-10和JS-11,以及青島的 S19檢測結(jié)果均為陽性,其余為陰性(表3)。針對ITS1-5.8S-ITS2區(qū)的測序結(jié)果表明藻類分離株JS-3-1、JS-10和JS-11為扁滸苔,而青島的S19分離株為滸苔(表3)。

3 討論

石莼屬綠藻作為一類海洋經(jīng)濟藻類,具有重要的食用和藥用價值(Hiqashi-Okajet al,1999; Ramanet al,2004; Mamathaet al,2007),其可能引發(fā)的綠潮災(zāi)害一直未引起足夠的重視。但是,近年來,由石莼屬綠藻引發(fā)的綠潮災(zāi)害在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)高發(fā)、頻發(fā)態(tài)勢,給當?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境以及海水養(yǎng)殖、旅游等產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生了巨大影響(Smetaceket al,2013)。2008年,青島附近黃海海域暴發(fā)了綠潮災(zāi)害,近萬人參與了藻體清除工作,花費多達3億美元(Liuet al,2013a),同時給近海的水產(chǎn)養(yǎng)殖造成的直接經(jīng)濟損失達10億美元(Yeet al,2011)。因此,建立準確、快速的藻類鑒定技術(shù)實現(xiàn)對石莼屬綠藻的有效監(jiān)測、預(yù)防和控制具有重要意義。

圖3 LAMP(a、b)和LAMP-LFD(c)的特異性實驗結(jié)果Fig.3 Specificity test of LAMP (a,b) and LAMP-LFD (c) for detection of U. compressaUcom1,扁滸苔55; Ucom2,扁滸苔SDF10; Ufle,曲滸苔SDF12;Ulin,緣管滸苔HS42; Uohn,曲滸苔FJ4; Uper,孔石莼SDF30;Upro,滸苔XS5; Atam,塔瑪亞歷山大藻NMBjah048; Gins,無紋環(huán)溝藻NMBjah046; Pdon,東海原甲藻NMBjah045; Stro,錐狀斯克里普藻NMBjah044; Haka,赤潮異彎藻H1; NC,不加任何DNA模板

目前,綠潮藻檢測技術(shù)的發(fā)展還相對滯后,傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察仍是主要判斷依據(jù)。石莼屬種類多,形態(tài)特征復(fù)雜且易隨環(huán)境改變而變化,形態(tài)學觀察的方法常常使得石莼屬藻類的鑒定出現(xiàn)混亂或難以判斷(Blomsteret al,1998; Maltaet al,1999),這就要求檢測人員必須具備較強的專業(yè)知識,即便如此,在實際操作中,也經(jīng)常出現(xiàn)結(jié)果的誤判。借助分子生物學的方法進行綠潮藻類的鑒定仍處于起步階段?；贗TS、二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因(rbcL)等基因序列的系統(tǒng)進化分析較早應(yīng)用于石莼屬藻類的種屬鑒定(Blomsteret al,1998; Coatet al,1998),作為傳統(tǒng)形態(tài)學觀察的一種輔助手段,在藻類鑒定方面取得了較好的應(yīng)用效果(Liuet al,2010; Wanget al,2010;Duanet al,2012)。Xiao等(2013)基于ITS建立了限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)的分析方法,結(jié)合 5S rDNA間隔區(qū)的PCR擴增技術(shù),成功地應(yīng)用于黃海海域常見石莼屬和盤苔屬藻類的種類鑒定。盡管如此,這些方法均未對自身的檢測靈敏度等指標進行描述。段維軍等(2012)通過比較分析石莼屬不同種類的 ITS序列,建立了可特異性檢測扁滸苔的PCR方法,最低可檢測到10 pg的扁滸苔基因組DNA。Zhang等(2014)以滸苔的5S rDNA間隔區(qū)為靶標建立了熒光原位雜交技術(shù)(FISH),利用該技術(shù)不僅可將滸苔與緣管滸苔、曲滸苔、扁滸苔、孔石莼,以及盤苔屬藻類區(qū)分開來,同時也能對滸苔完成定量分析。本研究建立的LAMP-LFD技術(shù),能夠?qū)⒈鉂G苔與滸苔、曲滸苔、緣管滸苔和孔石莼等石莼屬區(qū)分開來,而且針對塔瑪亞歷山大藻、無紋環(huán)溝藻、東海原甲藻、錐狀斯克里普藻和赤潮異彎藻等引發(fā)赤潮的常見藻類也表現(xiàn)出良好的特異性。利用該 LAMP-LFD方法,最低可檢測到 0.1 pg的扁滸苔基因組 DNA,是以 UcoITS-F3和UcoITS-B3為特異性引物的PCR方法的100倍。12個的野外樣本檢測結(jié)果顯示,LAMP-LFD技術(shù)的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察、PCR方法取得的結(jié)果基本一致,表明該方法有潛力成為我國沿海扁滸苔快速檢測的有效技術(shù)手段之一并加以推廣。

圖4 LAMP(a)、LAMP-LFD(b)和PCR(c)檢測扁滸苔的靈敏度比較Fig.4 Comparison in detection limit to U. Compressa by LAMP(a),LAMP-LFD (b),and PCR (c)NC: 不加任何DNA模板。LAMP-LFD檢測到的最低模板濃度為1.0×10–1 pg/μL; LAMP為1.0×100 pg/μL; PCR方法為1.0×101 pg/μL

圖5 LAMP(a)和LAMP-LFD(b)的重復(fù)性實驗Fig.5 Reproducibility of LAMP-LFD(a) and LAMP (b) for detection of U. compressaa. 以扁滸苔1.0×100 pg/μL濃度的基因組DNA為模板; NC,不加任何DNA模板。b. 以扁滸苔1.0×10–1 pg/μL濃度的基因組DNA為模板; NC,不加任何DNA模板

表3 利用顯微觀察、LAMP-LFD以及PCR方法對海水樣品中扁滸苔的檢測結(jié)果Tab.3 Detection of U. compressa from field samples by microscopic examination,LAMP-LFD,and PCR

基于 PCR或核酸雜交的檢測技術(shù)能夠適用于多數(shù)生物樣本的檢測,尤其適用于設(shè)備齊全的實驗室診斷領(lǐng)域。實時、便捷是分子生物學技術(shù)的重要指標,也是決定其能廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域現(xiàn)場檢測的主要因素。目前針對石莼屬藻類的檢測技術(shù)均體現(xiàn)出一定的適用性,但作為一種快檢技術(shù)應(yīng)用于藻類的現(xiàn)場檢測仍存在明顯的不適性。依賴于核酸測序的系統(tǒng)進化分析與傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察結(jié)合后能夠準確的確定藻類物種(Liuet al,2010; Wanget al,2010; Duanet al,2012),但該方法依賴于 PCR技術(shù),序列測定受制于相關(guān)公司,而且該方法需工作人員具備專業(yè)的系統(tǒng)進化知識,諸多限制使得本方法多在石莼屬藻類基礎(chǔ)性研究的實驗室使用。RFLP和常規(guī)PCR技術(shù)能夠快速完成石莼屬藻類的實驗室診斷(Duanet al,2012;Xiaoet al,2013),但需依賴于PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等儀器設(shè)備。本研究建立的LAMP-LFD技術(shù)在核酸擴增階段擺脫了對 PCR儀等昂貴儀器的依賴,在檢測階段也不再需要凝膠成像系統(tǒng)或濁度儀等設(shè)備,整個檢測完全可在室外完成; 而且特異性探針的引入也可避免熒光染料法造成的假陽性問題(Schnetzingeret al,2013)。同時,本研究建立的LAMP-LFD方法能夠在 60 min內(nèi)實現(xiàn)核酸的幾何級數(shù)擴增,完成整個檢測也僅需要不到70 min。因此,本研究建立的 LAMP-LFD方法作為一種快檢技術(shù),可作為扁滸苔現(xiàn)場檢測的重要工具并加以推廣。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)扁滸苔的 ITS1-5.8S-ITS2基因序列建立的LAMP-LFD方法可特異性檢測扁滸苔。該方法檢測靈敏度高,最低可檢測到0.1 pg的扁滸苔基因組DNA; 檢測時間短,從LAMP擴增到LFD結(jié)果判讀僅需70 min,且無需對待檢樣品進行培養(yǎng)、分離。該技術(shù)擺脫了對實驗室環(huán)境和儀器設(shè)備的依賴,對操作人員的技能要求較低,作為一種新型快檢技術(shù),有潛力成為扁滸苔現(xiàn)場檢測的重要手段。

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