吳登攀，廖 文，黃金蘭，陳文雅，何育爐，張晟瑞，鐘振國#（.徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇 徐州 004；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)新藥研究開發(fā)中心，南寧 53000）

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康，給人類帶來了巨大的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，抗腫瘤中草藥的發(fā)掘和篩選成為抗腫瘤的主要發(fā)展方向之一。夜香樹又名夜來香，主要分布于我國南方地區(qū)，為茄科夜香樹屬植物（Cestrum nocturnum，Linn.，簡稱CN）。CN 性溫、味辛，具行氣止痛、鎮(zhèn)定之功效，民間用于治療胃脘痛。研究報(bào)道，CN 提取物具有鎮(zhèn)痛、中樞抑制、局部麻醉[1]和抗糖尿病[2]作用。然而，其抗腫瘤方面的研究卻鮮見報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，CN 花、葉及嫩枝具有良好的抗腫瘤作用[3-4]，且其活性部位主要在正丁醇部位[5-6]。為進(jìn)一步研究CN正丁醇部位抗腫瘤作用的有效組分，筆者采用不同比例氯仿-甲醇（1 ∶9、1 ∶7）梯度洗脫正丁醇提取物得到流份C6 和C7，并選用人胃癌SGC7901 細(xì)胞為受試細(xì)胞，通過體外試驗(yàn)研究流份C6和C7的抗腫瘤活性，為開發(fā)CN的抗腫瘤功效提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

381型CO2培養(yǎng)箱（美國Life Technologies 公司）；TE2000-U 型倒置熒光顯微鏡（日本尼康株式會(huì)社）；Sunrise 型酶標(biāo)儀（美國Biocell Technology公司）。

1.2 藥材與試劑

CN葉采自廣西境內(nèi)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室劉壽養(yǎng)教授鑒定為茄科夜香樹屬植物夜香樹Cestrum nocturnum，Linn.的葉；胚胎牛血清（FBS）、RPMI1640 培養(yǎng)基（美國Life Technologies 公司）；MTT、碘化丙啶（PI）、Hoechst 33258染液（美國Sigma-Aldrich 公司，批號：080521、P-4170、23491-45-4，純度：98%、94%、98%）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)胞株

人胃癌SGC7901細(xì)胞株購自上海細(xì)胞生物研究所。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌SGC7901細(xì)胞株用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗(yàn)。

2.2 CN葉正丁醇部位流份C6、C7的提取

CN 葉經(jīng)日曬干燥后分別用95%、50%乙醇滲漉提取，并將兩部分浸膏合并得乙醇總浸膏。乙醇總浸膏用硅膠拌勻后，用水飽和正丁醇回流提取，得正丁醇部位浸膏，將浸膏烘干至恒質(zhì)量，精密稱定，計(jì)算浸膏得率：浸膏得率（%）＝浸膏質(zhì)量/藥材總質(zhì)量×100%。經(jīng)計(jì)算，正丁醇部位浸膏得率為1.25%。將正丁醇部位浸膏加無水乙醇溶解后用100～200目的硅膠拌樣并裝柱，依次用1 ∶9、1 ∶7（V/V）的氯仿-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，分別獲得流份C6、C7。

2.3 分組及干預(yù)方法

將對數(shù)生長期細(xì)胞分為空白組和給藥組。前期MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，流份C6、C7 在20 μg/ml 時(shí)對SGC7901 細(xì)胞的增殖抑制率分別為59.2%和55.5%。為進(jìn)一步探討其對SGC7901細(xì)胞的增殖抑制作用，筆者在本次MTT 試驗(yàn)中將給藥組C6、C7 質(zhì)量濃度均設(shè)置為5、10、20、40、80 μg/ml；在集落形成試驗(yàn)、瑞氏-姬姆薩混染試驗(yàn)和Hoechst33258/PI染色試驗(yàn)中給藥組C6、C7 的質(zhì)量濃度均為10 μg/ml。上述試驗(yàn)中的空白對照組則加入等體積的培養(yǎng)液。

2.4 MTT法測定流份C6、C7對SGC7901細(xì)胞的增殖抑制率

在96 孔培養(yǎng)板中按1 000 個(gè)細(xì)胞/孔加入200 μl 含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同質(zhì)量濃度的C6、C7，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h棄去上清液，按200 μl/孔加入新鮮制備的含0.2 mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，按200 μl/孔加入二甲基亞砜，振蕩混勻后，在酶標(biāo)儀上以波長為450 nm 測定光密度（OD450）值。按以下公式計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率：增殖抑制率（%）＝（1－試驗(yàn)組OD450值/空白對照組OD450值）×100%；用SPSS 11.5 軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 集落形成試驗(yàn)

取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單個(gè)分散細(xì)胞懸液，活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)液配成細(xì)胞密度為100 ml－1的細(xì)胞懸液，于35 mm培養(yǎng)皿中分別加入含和不含藥物的細(xì)胞懸液2 ml，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，棄去培養(yǎng)液，先用瑞氏染色液染色5 min，然后用姬姆薩染液與Sorensen 磷鉬酸緩沖液以1 ∶9 混合成工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）染色10 min，流水沖洗、晾干，在20倍的顯微鏡下計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的集落?？瞻讓φ战M以培養(yǎng)液代替受試藥物，結(jié)果以集落形成率和集落形成抑制率表示。集落形成率（%）＝集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，集落形成抑制率（%）＝1－集落數(shù)/空白對照組集落數(shù)×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 瑞氏-姬姆薩混染法觀察細(xì)胞形態(tài)

取對數(shù)生長期細(xì)胞，用含10% FBS 的PRMI1640 培養(yǎng)液配成1×105ml－1的細(xì)胞懸液，接種在35 mm 的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后，分別加入含和不含藥物的培養(yǎng)液2 ml，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，用甲醇固定10 min。染色操作同“2.5”項(xiàng)下方法。流水沖洗、晾干，鏡檢。

2.7 Hoechst33258/PI染色法觀察細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞的接種、培養(yǎng)同“2.6”項(xiàng)下方法。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液用PBS 洗1 次，加入2 mmol/L Hoechst 33258 2 μl 和50 μg/ml PI染色液20 μl。37 ℃下染色15 min，滴加封片液，在倒置熒光顯微鏡下紫外光激發(fā)，40倍物鏡觀察。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 流份C6、C7對SGC7901細(xì)胞增殖的影響

隨著C6 和C7 質(zhì)量濃度增加，對SGC7901 細(xì)胞增殖的抑制作用也增加，5 μg/ml C6 和C7 對SGC7901 細(xì)胞增殖的抑制率分別為22.1%和19.6%；當(dāng)C6和C7質(zhì)量濃度增加至80 μg/ml時(shí)，細(xì)胞增殖的抑制率分別達(dá)到80%和79.7%，表明流份C6和C7對SGC7901細(xì)胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性。流份C6、C7對SGC7901細(xì)胞的IC50分別為16.14、18.05 μg/ml，結(jié)果詳見表1。

表1 細(xì)胞增殖抑制率測定結(jié)果（，n＝3）Tab 1 Results of inhibitory rate of cells（，n＝3）

表1 細(xì)胞增殖抑制率測定結(jié)果（，n＝3）Tab 1 Results of inhibitory rate of cells（，n＝3）

3.2 流份C6和C7 對SGC7901細(xì)胞集落形成的影響

與空白對照組比較，流份C6、C7組（10 μg/ml）SGC7901細(xì)胞集落數(shù)、集落形成率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C6、C7 組（10 μg/ml）細(xì)胞集落形成抑制率分別為55.26%和50.00%，結(jié)果詳見表2。

表2 細(xì)胞集落形成率測定結(jié)果（，n＝3）Tab 2 Results of colony formation rate of cells（，n＝3）

表2 細(xì)胞集落形成率測定結(jié)果（，n＝3）Tab 2 Results of colony formation rate of cells（，n＝3）

注：與空白對照比較，＊P＜0.05Note：vs.blank control，＊P＜0.05

3.3 流份C6、C7對SGC7901細(xì)胞形態(tài)的影響

瑞氏-姬姆薩混染法染色結(jié)果顯示，空白對照組細(xì)胞的細(xì)胞膜較完整、胞質(zhì)透明、核膜完整、核大而圓；而C6和C7組的細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡而變圓變小、核質(zhì)固縮，詳見圖1A。

Hoechst33258/PI 染色結(jié)果顯示，由于正常細(xì)胞對染料有拒染性，故空白對照組細(xì)胞藍(lán)色和紅色的熒光較少；C6 和C7組均出現(xiàn)呈強(qiáng)藍(lán)色熒光的凋亡細(xì)胞及呈弱藍(lán)色、強(qiáng)紅色熒光的死細(xì)胞，詳見圖1B。

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果Fig 1 Morphology of cells

4 討論

利用MTT 和集落形成法，以抑制腫瘤細(xì)胞增殖為活性指標(biāo)，是目前一種經(jīng)濟(jì)、快速、簡便的藥物篩選方法。MTT 法可通過溶解于二甲基亞砜中甲臜結(jié)晶顏色的深淺來反映活細(xì)胞的生長能力[7]；而集落形成法可反映腫瘤細(xì)胞中具有增殖活性的干細(xì)胞的增殖能力[8]。細(xì)胞集落形成率下降說明腫瘤細(xì)胞群體中干細(xì)胞比例減少，對腫瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用[9]。本試驗(yàn)首先對流份C6 和C7 進(jìn)行MTT 試驗(yàn)，結(jié)果表明，流份C6和C7對SGC7901細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且抑制作用呈濃度依賴性（見表1）；然后采用集落形成法進(jìn)一步評價(jià)流份C6 和C7 對SGC7901 細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，流份C6 和C7在質(zhì)量濃度為10 μg/ml時(shí)即可顯著抑制SGC7901細(xì)胞的集落形成，且集落形成率與空白對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。上述結(jié)果提示，流份C6 和C7 可顯著抑制SGC7901 細(xì)胞增殖。

抗腫瘤藥物的抗腫瘤作用除了體現(xiàn)在抑制腫瘤細(xì)胞增殖以外，還包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死或凋亡[10]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，由于不斷脫水，會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)不斷濃縮、細(xì)胞體積減少、細(xì)胞核裂解產(chǎn)生凋亡小體等細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變[11]。因此，本試驗(yàn)首先采用瑞氏-姬姆薩混染法觀察藥物作用后SGC7901 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果表明，給藥組出現(xiàn)細(xì)胞變圓、體積變小、核質(zhì)固縮等典型的凋亡特征（圖1A）。此外，筆者還采用Hoechst33258/PI 染色法觀察藥物對SGC7901 細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響。PI可使壞死細(xì)胞著色，呈強(qiáng)紅色熒光；而Hoechst 33258可滲透過細(xì)胞膜，使活細(xì)胞染成紅色熒光，凋亡細(xì)胞染成藍(lán)色熒光[12]。由圖1B 可觀察到，給藥組可觀察到很多強(qiáng)藍(lán)色熒光的調(diào)亡細(xì)胞和呈弱藍(lán)色、強(qiáng)紅色熒光的死細(xì)胞，而空白對照組這兩種細(xì)胞少見。這些結(jié)果表明，CN 正丁醇提取物C6 和C7 可誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡。

綜上，CN 葉正丁醇提取物中流份C6 和C7 可顯著抑制SGC7901細(xì)胞增殖并可誘導(dǎo)其凋亡，具有很好的抗腫瘤作用，但其抗腫瘤作用的確切機(jī)制以及體內(nèi)抗腫瘤活性還需進(jìn)一步研究。此外，對篩選出的活性流份還需進(jìn)一步分離純化，以明確具有抗腫瘤活性的單體化合物。本試驗(yàn)為CN 葉的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。

[1]呂金燕，白蕊，鐘振國.夜香樹的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，15（2）：62.

[2]Kamboj A，Kumar S，Kumar V.Evaluation of antidiabetic activity of hydroalcoholic extract of cestrum nocturnum leaves in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Adv Pharmacol Sci，2013，doi：10.1155/2013/150401.

[3]趙世元，黃之虎，葉海洪，等.夜香樹花甾體皂苷誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡機(jī)制研究[J].中成藥，2013，35（3）：445.

[4]羅發(fā)軍，鐘振國，趙華平，等.夜香樹提取物對小鼠白血病L1210細(xì)胞生長的抑制作用[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（2）：335.

[5]鐘振國，趙世元，呂金燕，等.夜香樹提取物體內(nèi)抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥材，2008，31（11）：1 709.

[6]盧紅梅，鐘振國，趙世元，等.夜香樹花提取物體外抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（7）：1 704.

[7]Angius F，F(xiàn)loris A.Liposomes and MTT cell viability assay：an incompatible affair[J].Toxicol In Vitro，2015，29（2）：314.

[8]Masuda H，Asahara T.Clonogenic assay of endothelial progenitor cells[J].Trends Cardiovasc Med，2013，23（4）：99.

[9]Joo HJ，Seo HR，Jeong HE，et al.Smooth muscle progenitor cells from peripheral blood promote the neovascularization of endothelial colony-forming cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，449（4）：405.

[10]Droin N，Guery L，Benikhlef N，et al.Targeting apoptosis proteins in hematological malignancies[J].Cancer Letters，2011，332（2）：325.

[11]Jendrossek V.Targeting apoptosis pathways by celecoxib in cancer[J].Cancer Letters，2013，332（2）：321.

[12]Cai L，Chen ZZ，Dong XM，et al.Silica nanoparticles based label-free aptamer hybridization for ATP detection using hoechst33258 as the signal reporter[J].Biosens Bioelectron，2011，29（1）：46.