田 雨，陳普成，趙玉輝，姜永萍，柳金雄，陳化蘭

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150001)

禽流感病毒(Avian influenza viruses，AIV)屬于正粘病毒科流感病毒屬，病毒基因組分為8 個(gè)節(jié)段，全長(zhǎng)約13.6 nt，編碼至少10 種蛋白：PB1、PB2、PA、HA、NA、NP、M1、M2、NS1 和NS2。H5N1 亞型AIV 為高致病性AIV(HPAIV)，其感染能夠?qū)е虑蓊?lèi)的高死亡率，同時(shí)也嚴(yán)重的危害人類(lèi)的健康[1]。

一般認(rèn)為，網(wǎng)格蛋白(Clathrin)和小窩蛋白(Caveolae)分別介導(dǎo)的兩種內(nèi)吞途徑為流感病毒侵入細(xì)胞的主要方式[2]。這兩種內(nèi)吞途徑均依賴(lài)于GTP蛋白激酶Dynamin 2[3]。Dynasore 是最新發(fā)現(xiàn)的針對(duì)Dynamin 蛋白的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，能夠抑制網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的病毒侵入[4]。然而，在胎牛血清的存在的體外病毒培養(yǎng)條件下，Dynasore 仍然可以抑制只通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的水皰性口炎病毒(VSV)侵入，表明胎牛血清并未導(dǎo)致Dynasore 失活[5]。

巨胞飲(Macropinocytosis)是細(xì)胞在某些因素刺激下，細(xì)胞膜皺褶形成大且不規(guī)則的原始內(nèi)吞小泡，非選擇性地內(nèi)吞細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和液相大分子的過(guò)程[6]。研究表明，5-(N-乙基-N-異丙基)阿米洛利(EIPA)能夠特異性抑制巨胞飲作用[7]。

作為親本病毒，H5N1 亞型AIV A/duck/Guangxi/35/2001(DK/35)具有禽源和人源SAα2,3Gal/SAα2,6Gal受體的雙重親和性。然而，通過(guò)其HA 蛋白Q226L 和G228S 點(diǎn)突變的重組病毒rDK35/HA-Q226L/G228S，或HA 蛋白經(jīng)A160T 點(diǎn)突變的重組病毒rDK35/HA-A160T則僅具有SAα2,6Gal 人源受體親和性，或僅具有SAα2,3Gal 禽源受體結(jié)合[8-9]。

本研究利用Dynasore 抑制通過(guò)網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的病毒侵入方式，在體外胎牛血清(FBS)存在的情況下，證明流感病毒可以通過(guò)巨胞飲方式進(jìn)入細(xì)胞，即FBS 能夠誘導(dǎo)H5N1 亞型AIV 通過(guò)巨胞飲方式進(jìn)入細(xì)胞，為進(jìn)一步研究體內(nèi)AIV 感染細(xì)胞的機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株及細(xì)胞 DK/35(禽源和人源受體雙重親和性)、rDK35/HA-Q226L/G228S(人源受體親和性)和rDK35/HA-A160T(禽源受體親和性)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；雞成纖維細(xì)胞系(DF1)、犬腎傳代細(xì)胞系(MDCK)、人肺癌細(xì)胞系(A549)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM、F-12K、opti-MEM 購(gòu) 自Gibco 公 司；FBS 購(gòu) 自Biochrom 公司；Dynasore、EIPA 購(gòu)自Sigma 公司；神經(jīng) 氨酸苷酶購(gòu)自NEB 公司；FITC 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(FITC-IgG)購(gòu)自Millipore 公司；抗AIV NP 多克隆抗體(PcAb)為本實(shí)驗(yàn)室制備；生物素-鏈霉親和素封閉試劑盒、生物素標(biāo)記的與SAα2,3Gal 結(jié)合的山槐凝集素(MAA I 與 MAA II)及 FITC 標(biāo)記的與SAα2,6Gal 結(jié)合的接骨木凝集素(SNA)均購(gòu)自Vector公司；DyLight 594 標(biāo)記的鏈霉親和素、紅色熒光素NHS-Rhodamine 標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Thermo scientific 公司。

1.3 間接免疫熒光(IFA)及流式細(xì)胞術(shù)(FCM)將染毒16 h 后的細(xì)胞采用PBS 清洗3 次，加入4 %的多聚甲醛室溫固定20 min，棄去固定液，加入1 %BSA 室溫封閉30 min。以抗NP 血清為一抗(1∶200)，IgG-FITC 作為二抗(1∶500)。通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光量。

1.4 Dynasore 工作濃度確定 將Dynasore 以細(xì)胞培養(yǎng)液F-12K 配制成不同濃度梯度的溶液，分別加入6 孔板中培養(yǎng)的A549 細(xì)胞單層，37 ℃孵育30 min后置于冰上10 min，將0.5 MOI 的DK/35 感染A549細(xì)胞，2 h 后去除上清，再次換入不同濃度的Dynasore 溶液。16 h 后通過(guò)IFA 檢測(cè)感染數(shù)量確定最佳工作濃度。

1.5 病毒在Dynasore 作用下的侵入試驗(yàn) 將DK/35 純化滅活后，使用NHS-Rhodamine 標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記，感染A549 4 h 后，固定，染核，通過(guò)共聚焦顯微鏡觀(guān)察病毒定位情況。

1.6 FBS 對(duì)Dynasore 作用的影響 將上述試驗(yàn)中的F-12K 純培養(yǎng)液加入10 %的FBS 后按照最佳濃度重復(fù)上述1.4 中的實(shí)驗(yàn)步驟，16 h 后進(jìn)行IFA 鑒定，取上清測(cè)定病毒TCID50。

1.7 EIPA 對(duì)于巨胞飲作用的影響 將Dynasore 的F-12K(10 % FBS)溶液加入濃度為75 μM 的EIPA，重復(fù)1.4 中實(shí)驗(yàn)步驟，2 h 后換液時(shí)去除EIPA，16 h后采用NP 蛋白的IFA，進(jìn)行鑒定。

1.8 MDCK、DF1 的巨胞飲方式的驗(yàn)證 分別采用MDCK、DF1 細(xì)胞采用最佳工作濃度重復(fù)1.4 的實(shí)驗(yàn)步驟，分別DMEM、10%血清的DMEM、Dynasore+DMEM、Dynasore+10 %血清的DMEM 重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，16 h 后進(jìn)行IFA 鑒定。

1.9 A549 細(xì)胞表面α-2,3、α-2,6 受體的鑒定將形成單層的細(xì)胞經(jīng)4 %多聚甲醛固定20 min，以生物素、鏈霉素分別封閉15 min，加入MAAI、MAAII(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的SNA(1∶500)37 ℃孵育1 h，DyLight 594 標(biāo)記的鏈霉親和素(1∶500)37 ℃孵育1 h，通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察不同波長(zhǎng)處的熒光。

1.10 不同受體結(jié)合特性病毒的Dynasore 試驗(yàn)將0.5 MOI 的rDK35/HA-Q226L/G228S 和rDK35/HAA160T 采用最佳Dynasore 工作濃度重復(fù)1.4 中實(shí)驗(yàn)步驟，16 h 后進(jìn)行NP 蛋白的IFA 鑒定。

1.11 去除唾液酸細(xì)胞的病毒感染試驗(yàn) 將傳代懸浮細(xì)胞，加入神經(jīng)氨酸酶37 ℃作用1 h 后鑒定α-2,3、α-2,6 受體的存在。確定作用時(shí)間后進(jìn)行以最佳工作濃度重復(fù)1.4 中實(shí)驗(yàn)步驟，16 h 進(jìn)行NP 蛋白的IFA鑒定，觀(guān)察其熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 Dynasore 工作濃度的確定 根據(jù)特異性熒光強(qiáng)度，確定80 μM 為Dynasore 的最佳工作濃度。濃度小于80 μM 的Dynasore 不能完全抑制病毒感染，而80 μM 的Dynasore 幾乎能完全抑制病毒感染，即通過(guò)網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的病毒侵入作用幾乎完全被80 μM Dynasore 抑制。共聚焦顯微鏡下顯示，在Dynasore 存在的情況下，病毒聚集在細(xì)胞膜上，并不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)(圖1A)，而空白對(duì)照組中，AIV 能夠直接進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行下一步復(fù)制(圖1B)。

圖1 Dynasore 作用下的病毒感染Fig.1 The infection of AIV in cells with 80 μM Dynasore

2.2 FBS 誘導(dǎo)的病毒侵入方式 將DK/35 接種于含有80 μM 的Dynasore 的含10 % FBS 培養(yǎng)液中的A549 單層細(xì)胞，同時(shí)設(shè)無(wú)血清對(duì)照組，以抗AIV NP 蛋白的PcAb 為一抗，F(xiàn)ITC-IgG 為二抗，通 過(guò)IFA 鑒定流感病毒的復(fù)制情況。結(jié)果表明，在FBS存在的情況下，Dynasore 不能夠完全抑制病毒的感染，而在含有Dynasore 的無(wú)血清培養(yǎng)液中的病毒感染能力是完全被抑制的，病毒不能感染細(xì)胞(圖2)。同樣，F(xiàn)-12K 培養(yǎng)液、Dynasore 溶液、10 %血清的F-12K 培養(yǎng)液及10 %血清的80 μM 的Dynasore 溶液上清經(jīng)TCID50滴定結(jié)果中，最高的為F-12K 純培養(yǎng)液，略高于10 % FBS 組，其次為Dynasore 的FBS組，最低的為Dynasore 組。細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定同型對(duì)照的熒光百分比為1.0 %，結(jié)果顯示，加入血清后，流感病毒感染細(xì)胞的比例相較Dynasore 有了大幅度的提高。因此，在FBS 存在的情況下，可能存在不依賴(lài)于網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的侵入方式(表1)。

圖2 FBS 誘導(dǎo)病毒侵入方式Fig.2 Induced methods of virus cell entry

表1 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)果Table 1 Detection of the virus infected cells by flow cytometry

2.3 EIPA 對(duì)巨胞飲在侵入過(guò)程中作用的鑒定 將DK/35 接種于含有75 μM EIPA 的80 μM 的Dynasore 10 % FBS 培養(yǎng)液中的A549 單層細(xì)胞，16 h 后進(jìn)行IFA 鑒定。結(jié)果表明，F(xiàn)BS 能夠使病毒在Dynasore 存在的情況下進(jìn)入細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制，加入EIPA 后，病毒不能侵入細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，即在FBS的誘導(dǎo)下不依賴(lài)于網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白的病毒侵入方式為巨胞飲(圖3)。

2.4 巨胞飲作用在病毒侵入DF1 和MDCK 中的作用 將4 種溶液分別作用于DF1、A549、MDCK 單層細(xì)胞后，以0.5 MOI 的DK35 感染細(xì)胞16 h 后，采用IFA 判定病毒的擴(kuò)增。結(jié)果表明，在無(wú)血清的Dynasore 培養(yǎng)液的條件下，病毒侵入3 種細(xì)胞均被抑制，在10 % FBS 存在的情況下，同等濃度Dynasore 的抑制作用均存在不同程度的削弱(圖4)，病毒可以侵入細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制。即在A(yíng)549、DF1、MDCK中，純培養(yǎng)液的80 μM Dynasore 中，網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑均被抑制，而FBS 均可以誘導(dǎo)流感病毒通過(guò)巨胞飲方式進(jìn)入細(xì)胞。

圖3 EIPA 確認(rèn)巨胞飲作用在侵入過(guò)程中發(fā)揮作用Fig.3 Identification of the macropinocytosis for virus infection by inhibitor EIPA

圖4 巨胞飲作用在病毒侵入不同來(lái)源細(xì)胞的作用Fig.4 AIV infected different origins of cells via macropinocytosis under the fetal bovine serum condition

2.5 巨胞飲作用在不同受體結(jié)合特性的病毒侵入中的作用 將DK/35(禽源和人源受體雙重親和性)、rDK35/HA-Q226L/G228S(人源受體親和性)和rDK35/HA-A160T(禽源受體親和性)感染細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，利用針對(duì)抗NP 的IFA 判斷其熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，這3 種不同受體親和性的病毒在FBS 存在情況下，均可以通過(guò)巨胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞(圖5)。

圖5 不同受體結(jié)合特性病毒均可通過(guò)巨胞飲作用感染細(xì)胞Fig.5 Viruses of different receptor affinity infected cells through macropinocytosis

2.6 A549 表面的唾液酸受體分布及唾液酸受體缺失對(duì)巨胞飲作用作用的影響 使用MAA 對(duì)α-2,3 進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)Dylight594 標(biāo)記，結(jié)果顯示α-2,3 呈現(xiàn)紅色熒光(圖6A)；使用SNA 對(duì)α-2,6 受體進(jìn)行標(biāo)記，F(xiàn)ITC 標(biāo)記，結(jié)果顯示α-2,6 呈現(xiàn)綠色熒光(圖6B)。通過(guò)染色結(jié)果判定A549 表面同時(shí)存在α-2,3、α-2,6 受體。處理去除唾液酸受體后，再次進(jìn)行Dynasore 試驗(yàn)，根據(jù)針對(duì)NP 的IFA 檢測(cè)可以得出結(jié)論，去除唾液酸受體后，即使在FBS 存在的情況下，Dynasore 溶液中3 種不同受體親和性的病毒也不能侵入細(xì)胞(圖6C、D、E)。

圖6 唾液酸受體缺失對(duì)巨胞飲作用的影響Fig.6 Identification of the virus infection in the removed receptors A549 cells

3 討論

巨胞飲作用與網(wǎng)格蛋白或小窩蛋白介導(dǎo)的侵入方式不同，巨胞飲體的大小不一，沒(méi)有網(wǎng)格蛋白或小窩蛋白包被，巨胞飲作用目前被認(rèn)為具有清除凋亡細(xì)胞、參與免疫反應(yīng)、介導(dǎo)部分病原菌侵襲細(xì)胞、更新細(xì)胞膜等功能[5]。然而，本研究通過(guò)對(duì)侵入方式的研究，探索出H5N1 亞型流感病毒侵入細(xì)胞的其他方式，通過(guò)驗(yàn)證得知巨胞飲作用在其中發(fā)揮作用。而近年來(lái)，H5N1 亞型AIV 對(duì)人類(lèi)的健康造成了嚴(yán)重的威脅，本實(shí)驗(yàn)為深入了解流感病毒的感染機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)思路。

利用巨胞飲作用不依賴(lài)于Dynamin 蛋白的特性，采用Dynasore 抑制依賴(lài)于Dynamin 蛋白的網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑。在不含F(xiàn)BS 的情況下，Dynasore 能夠抑制病毒侵入。在10 % FBS 的作用下，F(xiàn)BS 誘導(dǎo)出非Dynamin 依賴(lài)性的侵入方式，采用EIPA 驗(yàn)證后，證明巨胞飲作用在新的侵入方式發(fā)揮作用。通過(guò)巨胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞在不同種源的細(xì)胞和不同親和性的病毒中均存在，可以繼續(xù)推斷細(xì)胞種源及唾液酸受體親和性對(duì)于巨胞飲的侵入在很大程度上沒(méi)有影響。然而將細(xì)胞表面的唾液酸受體去除后，巨胞飲的侵入方式也隨即失效，病毒不能侵入細(xì)胞，表明通過(guò)巨胞飲作用侵入的病毒也是依賴(lài)于細(xì)胞表面的唾液酸受體的。最新研究表明，病毒的形態(tài)對(duì)于巨胞飲作用的存在可能也會(huì)起作用[10]。

流感病毒采取多種方式進(jìn)入細(xì)胞，大量復(fù)制后感染機(jī)體。因此，對(duì)于流感病毒侵入細(xì)胞進(jìn)行清楚徹底的研究和認(rèn)知，有助于我們對(duì)流感病毒致病機(jī)理的進(jìn)一步探究，以及對(duì)于流感病毒的防控提供新的思路和想法。

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