劉云龍，宋 卓，彭冰潔，許詩(shī)豪，朱 琪，王 征

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

研究顯示，肝細(xì)胞凋亡在非酒精性脂肪肝形成和發(fā)展中起著十分關(guān)鍵的作用［1，2］。Fas/FasL 途徑是機(jī)體行使正常生理功能不可或缺的一部分，正常情況下FasL表達(dá)量很低，但當(dāng)處于病理狀態(tài)下時(shí)，F(xiàn)asL 表達(dá)量升高，通過(guò)Fas/FasL 途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡。Fas/FasL 途徑在肝臟疾病發(fā)生、腫瘤的控制以及免疫系統(tǒng)的維持等方面均扮演著重要的角色［3，4］。綠原酸具有調(diào)節(jié)血糖濃度與脂代謝，治療胰島素抵抗以及清除過(guò)氧自由基等功能，但對(duì)于綠原酸是否具有抗細(xì)胞凋亡作用以及對(duì)肝細(xì)胞是否具有保護(hù)作用的研究報(bào)道較少［5，6］。本文通過(guò)給予大鼠長(zhǎng)期飼喂高脂飼料的方法建立非酒精性脂肪肝的凋亡模型，經(jīng)綠原酸干預(yù)，研究綠原酸對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

體重210～230g SPF 級(jí)的雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠40 只，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;綠原酸，成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司;Trizol，美國(guó)Invirtrogen 公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒，天根生化科技有限公司;PCR mix，天根生化科技有限公司;TC 試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;TG 試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;HDL-C，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;LDL-C 測(cè)定試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。飼料:普通飼料見(jiàn)表1，總能量為3 520kcal/kg;高脂飼料見(jiàn)表2，總能量為4 976.51kcal/kg，均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司生產(chǎn)。

表1 普通飼料配方

表2 高脂飼料配方

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組和建模 SD 大鼠7d 適應(yīng)期喂養(yǎng)后，將其隨機(jī)分成4 組:空白對(duì)照組(NC 組)、模型組(HFD組)、低劑量綠原酸防治組(HFD-LC 組)和高劑量綠原酸防治組(HFD-HC 組)。NC 組飼喂普通飼料，其余各組飼喂高脂飼料，自由飲水?dāng)z食。其中，依據(jù)個(gè)體的體重，HFD-LC 和HFD-HC 組分別按照綠原酸20、90mg/(kg·d)劑量進(jìn)行灌胃;NC 組和HFD 組則每天灌胃等體積超純水。每天09:30 定時(shí)測(cè)定大鼠體重，12w后處死，測(cè)量各項(xiàng)生理生化指標(biāo)。

1.2.2 血清中TG、TC、LDL-C 和HDL-C 含量的測(cè)定采用眼球取血法，取血后將血液靜置2 h，2 000 r/min，離心15 min，分離得到血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)依次檢測(cè)各項(xiàng)數(shù)據(jù)。

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè)肝臟凋亡相關(guān)因子mRNA 表達(dá)量

TRIZOL 法提取肝臟組織RNA，用微量光度計(jì)檢測(cè)純度和含量;取1g RNA，按照試劑盒步驟反轉(zhuǎn)成cDNA(體積20L);以cDNA 做為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。采用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，GAPDH 作為管家基因。PCR 反應(yīng)體系:cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，總計(jì)25 μL。反應(yīng)條件如下:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增29 個(gè)循環(huán);最后再在72 ℃保持5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1 % 瓊脂糖凝膠電泳30～40 min，使用凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)掃描拍照，并用Quantity One 進(jìn)行相對(duì)表達(dá)率的半定量分析。

1.2.4 肝臟切片HE 染色 取大鼠肝組織，用10 %甲醛溶液固定24h，常規(guī)石蠟包埋，切成3～5 μm 的厚切片，脫蠟，先后用蘇木精和伊紅染色，脫水，透明，封片，電鏡下觀察肝臟細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異比較采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均以±s表示，P＜0.05 時(shí)，認(rèn)為具有顯著性差異;P＜0.01 時(shí)，認(rèn)為具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸對(duì)大鼠體重的影響

由表3 可知，飼喂12w 后，相比于HFD 組，HFD-HC組大鼠體重及體重增加量顯著降低，其他均無(wú)顯著差異。

表3 綠原酸對(duì)大鼠體重的影響 單位:g

2.2 綠原酸對(duì)大鼠肝濕重和肝指數(shù)的影響

由表4 可見(jiàn)，相比于NC 組，HFD 組大鼠肝濕重和肝指數(shù)極顯著增加(P＜0.01);相比于HFD 組，HFDLC 組和HFD-HC 組的肝濕重顯著降低(P＜0.05)。

表4 綠原酸對(duì)大鼠肝濕量和肝指數(shù)的影響

2.3 綠原酸對(duì)大鼠血清中TC、TG 、HDL-C、LDL-C、HDL-C/LDL-C 的影響

由表5 可知，與NC 組相比，HFD 組HDL-C 和FFA含量顯著增加，TC 和LDL-C 含量極顯著增加。與HFD 組相比，HFD-LC 組的TC 和FFA 含量顯著下降;HFD-HC組的HDL-C 和FFA 含量顯著下降，TC 和LDL-C 含量極顯著下降，HDL-C/LDL-C 的值顯著升高。

表5 綠原酸干預(yù)對(duì)大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、HDL-C/LDL-C 的影響

2.4 綠原酸對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)Fas、FasL 以及Caspase-8 表達(dá)量的影響

由圖1 可知，與NC 組相比，HFD 組肝臟組織中Fas 和Fasl 表達(dá)量極顯著性升高，Caspase-8 表達(dá)量顯著性升高;與HFD 組相比，HFD-LC 組肝臟組織中Fas、Fasl 和Caspase-8 表達(dá)量均有降低，但差異性不顯著，HFD-HC 組肝臟組織中Fas 和Fasl 表達(dá)量顯著性降低，Caspase-8 表達(dá)量有所降低，但差異性不顯著。

2.5 綠原酸對(duì)大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化的影響

由圖2 可知，NC 組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，各細(xì)胞大小一致且排列緊密，細(xì)胞之間空隙較少，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，無(wú)脂肪空泡，胞核清晰明顯無(wú)破碎現(xiàn)象。與NC 組對(duì)比，HFD 組細(xì)胞膨脹變大呈圓形(圖中箭頭所示)，細(xì)胞核染色加深并碎裂成多個(gè)小核，胞質(zhì)中充滿(mǎn)大量的脂肪性空泡等病理癥狀。與HFD 組相比，HFD-LC 組中空泡數(shù)量減少、胞質(zhì)分布較均勻，細(xì)胞核破碎現(xiàn)象減少，病理癥狀有所改善;HFD-HC 組細(xì)胞形態(tài)則與NC組相似，胞質(zhì)中幾乎無(wú)大型脂肪空泡出現(xiàn)，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)也更加完整。

3 討論

對(duì)脂肪肝模型的建立，科研人員也常常是通過(guò)給動(dòng)物長(zhǎng)期飼喂高脂飼料而實(shí)現(xiàn)的［7］。長(zhǎng)期的高脂飲食將會(huì)導(dǎo)致體重與肝臟重量的增加，血液中TC、TG 以及HDLC/ LDL-C 值的減少。HFD 組中TG 與TC 值的升高說(shuō)明機(jī)體出現(xiàn)高血糖和高血脂癥狀，HDL-C/ LDL-C 值的減少說(shuō)明肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇能力下降。當(dāng)攝入脂肪量超過(guò)肝臟對(duì)脂肪的分解與轉(zhuǎn)運(yùn)能力之后，將會(huì)導(dǎo)致脂肪在肝臟組織的堆積，進(jìn)而引發(fā)脂肪肝。通過(guò)綠原酸干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，綠原酸能夠有效降低體重與肝重量，調(diào)節(jié)糖脂代謝，降低血糖與血脂含量，并且升高HDL-C/ LDL-C 的值，這與Meng S 等［8］所發(fā)現(xiàn)的綠原酸能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖血脂平衡，促進(jìn)脂肪代謝等結(jié)論一致。

非酒精性脂肪肝的發(fā)病與肥胖、高脂血癥、糖尿病等有關(guān)，其主要表現(xiàn)為肝臟細(xì)胞的脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡為主要特征的病理癥狀［9-10］。以往對(duì)非酒精性脂肪肝的研究主要集中在胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂、以及氧化應(yīng)激等［11-12］。肝細(xì)胞凋亡是許多肝病的共同發(fā)病機(jī)制之一，F(xiàn)eldstein A E 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，脂肪肝將導(dǎo)致機(jī)體肝細(xì)胞的凋亡，同時(shí)還有研究顯示，肝細(xì)胞凋亡的程度隨著脂肪肝的加劇細(xì)胞凋亡數(shù)目進(jìn)一步增多［14］。Fas/FasL 途徑介導(dǎo)的信號(hào)通路是細(xì)胞凋亡通路的主要的途徑之一，在此途徑中，細(xì)胞膜表面存在受體Fas，由于各種理化因素導(dǎo)致配體FasL 表達(dá)量上升，當(dāng)配體FasL 與其相應(yīng)受體Fas 相結(jié)合時(shí)將會(huì)誘導(dǎo)Fas 胞漿內(nèi)部分與FADD 接頭蛋白形成三聚體，當(dāng)三聚體形成后，再將凋亡信號(hào)傳遞給Caspase-8 蛋白酶原，Caspase-8 蛋白酶原經(jīng)過(guò)自我催化修飾轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘腃aspase-8，繼而通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活下游的其他效應(yīng)蛋白酶而最終誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡［15-16］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期高脂飲食將會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞FasL、Fas 以及Caspase-8 表達(dá)量的上升，繼而引發(fā)肝細(xì)胞凋亡，經(jīng)綠原酸干預(yù)后，F(xiàn)asL、Fas 以及Caspase-8 表達(dá)量明顯下降，其原因可能為:長(zhǎng)期的高脂將會(huì)加重肝細(xì)胞的氧化分解負(fù)擔(dān)，肝細(xì)胞進(jìn)行氧化分解反應(yīng)的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的代謝中間產(chǎn)物，特別是一些活性氧和自由基，當(dāng)這些活性氧與自由基含量超過(guò)肝細(xì)胞的消除能力時(shí)，將會(huì)引起肝細(xì)胞氧化應(yīng)激現(xiàn)象，進(jìn)而激活Fas/FasL 系統(tǒng)，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。

4 結(jié)論

一定劑量的綠原酸能夠調(diào)節(jié)糖脂代謝，控制機(jī)體體重，有效緩解因長(zhǎng)期高脂飲食所導(dǎo)致的非酒精性脂肪肝癥狀。綠原酸還能通過(guò)Fas/FasL 系統(tǒng)與Caspase-8 調(diào)控肝細(xì)胞的增殖與凋亡，表明綠原酸對(duì)肝細(xì)胞具有一定的調(diào)節(jié)作用，并且高劑量作用效果更加明顯。

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