朱泓全，唐雪姣，王 楊，朱艷霞，周 紅，楊艷彬，張 玫，姬 華

(石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000)

大腸桿菌(Escherichia coli)周生鞭毛和菌毛，是人和溫血動物腸道重要的兼性厭氧寄居菌群，也是水源和食品糞便污染指示菌。大腸桿菌通常對人體無害，是人和溫血動物腸道中的優(yōu)勢菌群，但在大腸桿菌屬中還存在一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物具有致病性［1，2］。預(yù)測微生物學(xué)是一個將微生物學(xué)、數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)結(jié)合在一起的研究領(lǐng)域，通過建立數(shù)學(xué)模型來預(yù)測微生物在一系列環(huán)境條件下的生長、死亡情況。這些環(huán)境條件包括pH 值、水分活度(aw)、溫度、氣體環(huán)境等［3］。大腸桿菌是良好的衛(wèi)生指示菌，對即食食品中大腸桿菌生長模型的研究可以用于食品微生物風(fēng)險評估，為控制有害大腸桿菌提供科學(xué)的數(shù)據(jù)。本研究以即食食品鹵雞腿為載體，測定不同溫度條件下大腸桿菌在鹵雞腿中的增長動態(tài)，通過修正的Gompertz 方程擬合基于溫度變化條件下大腸桿菌一級生長動力學(xué)模型，應(yīng)用平方根模型描述了溫度對大腸桿菌最大比生長速率和延滯時間的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大腸桿菌16Z，分離自豬血樣品，石河子大學(xué)食品學(xué)院微生物實驗室保存。鹵雞腿，購自石河子大學(xué)綠苑食堂(雞腿出鍋后立即無菌操作運至實驗室接菌處理)。實驗用LB 培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

自動滅菌鍋，上海弘芯電子科技有限公司;生化培養(yǎng)箱，SPX-250B-Z 型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;凈化工作臺SW-CJ 型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;干燥箱，JINGHONG-53L，上海志泰設(shè)備有限公司;低溫冷藏箱，BCD-268E 上海領(lǐng)德儀器有限公司;電熱培養(yǎng)箱，HPX-9272 MBE 型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 活化及制備菌液 大腸桿菌16Z 接種于5mL 的LB 培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)18h，將該菌體用0.85%生理鹽水配制成0.5 麥?zhǔn)蠞岫染骸Ｓ靡埔簶屛?mL 0.5 麥?zhǔn)蠞岫鹊拇竽c桿菌菌液于99mL 0.85%生理鹽水錐形瓶中，充分振搖;用移液槍吸取1mL 錐形瓶中的大腸菌液置于另一份99mL 0.85%生理鹽水中，充分振搖。此時所制得的菌液將作為大腸桿菌接菌液備用。

1.2.2 樣品的制備 將鹵雞腿先用75%酒精棉球擦拭表面，然后無菌分割成約1.0 cm ×1.0 cm 的小塊，去皮、去骨。將肉塊置于無菌容器中，紫外翻轉(zhuǎn)殺菌［4］。以保證鹵雞腿沒有外源污染菌。

1.2.3 樣品接菌及保藏 將雞腿肉片放入大腸桿菌接菌液中，充分浸泡15 s，保證樣品與菌液充分接觸。將已接種大腸桿菌的雞肉片放入無菌均質(zhì)袋中，每袋25g樣品。分別放入20℃、25℃、30℃、35℃和40℃的條件下保藏。保存于40℃、35℃、30℃條件下的樣品每隔2h 取出，進(jìn)行菌落計數(shù);保存于25℃下的樣品每隔3h 取出，進(jìn)行菌落計數(shù);保存于20℃的樣品每隔4h取出，進(jìn)行菌落計數(shù);每個樣品做2 個平行試驗，取平均數(shù)用于數(shù)據(jù)分析。菌落計數(shù)以菌落形成單位(colonyforming units，CFU)表示，按GB4789.2-2010 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行菌落計數(shù)［5］。

1.3 大腸桿菌生長曲線擬合

1.3.1 大腸桿菌一級生長模型 利用在20℃、25℃、30℃、35℃和40℃條件下鹵雞腿中大腸桿菌增長動態(tài)數(shù)據(jù)，采用修正的Gompertz 方程擬合大腸桿菌一級生長模型，實驗數(shù)據(jù)用Origin8.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行非線性回歸。修正的Gompertz 方程如(1)式［6-9］:

(1)式中，Nt—t 時的微生物數(shù)量，log (cfu/g);N0—初始微生物數(shù)量，log (cfu/g);a、b、c—待定系數(shù)。

最大比生長率μm:μm=a·c/e;延滯時間λ:λ=(b－1)/c;最大菌數(shù)Nmax:Nmax=N0+a。

1.3.2 溫度對大腸桿菌生長影響的二級生長模型Ratkowsky 等根據(jù)微生物在0—40℃溫度條件下，生長速率或延滯時間倒數(shù)的平方根與溫度之間存在的線性關(guān)系，提出平方根 (Belehradek)方程，方程式如(2)式［8-11］。

(2)式中，Tmin—假設(shè)的概念，指的是微生物沒有代謝活動的溫度;μm—最大比生長速率;λ—延滯時間;b—方程的常數(shù)。本實驗數(shù)據(jù)利用CurveExpert 軟件進(jìn)行擬合。

1.3.3 大腸桿菌生長動力學(xué)模型的驗證和可靠性評價應(yīng)用擬合的大腸桿菌一級生長模型求得20℃、25℃、30℃、35℃和40℃時大腸桿菌菌數(shù)預(yù)測值，與試驗中實際檢測的大腸桿菌生長數(shù)值進(jìn)行比較，采用偏差因子(Bias factor，Bf)和準(zhǔn)確因子(Accuracy factor，Af)評價大腸桿菌一級生長動力學(xué)模型的可靠性如 (3)式［9，11］。

(3)式中，N實測—實驗實際測得的大腸桿菌數(shù)量，log (cfu/g);N預(yù)測—應(yīng)用微生物生長動力學(xué)模型得到的與N實測同一時間的大腸桿菌數(shù)量，log (cfu/g);n—實驗次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌的一級動力學(xué)模型

利用修正的Gompertz 方程擬合在20℃、25℃、30℃、35℃和40℃條件下大腸桿菌的生長數(shù)據(jù)，根據(jù)修正Gompertz 方程對大腸桿菌的生長曲線進(jìn)行回歸，擬合方程如表1。

表1 大腸桿菌一級生長模型和相關(guān)系數(shù)

相關(guān)指數(shù)R2可以評估回歸方程對樣本數(shù)據(jù)擬合效果的好壞。R2值越接近1，表明估計的回歸方程對樣本數(shù)據(jù)的擬合效果越好，R2值越接近于0 表明方程擬合效果越差［8］。由表1 可知，修正的Gompertz 模型適合擬合大腸桿菌在鹵雞腿中的生長狀況;從擬合效果可知，相關(guān)指數(shù)R2都在0.933 6 以上，說明修正Gompertz 模型都能夠充分地預(yù)測20—40℃溫度范圍內(nèi)大腸桿菌在鹵雞腿中的生長規(guī)律。

表2 反應(yīng)了在修正Gompertz 模型的基礎(chǔ)上，計算出不同溫度條件下大腸桿菌的最大比生長速率μm、延滯時間λ 以及最大細(xì)菌濃度Nmax。由表2 可知，隨著貯藏溫度的升高，生長速率總體呈上升趨勢。延滯時間λ 隨溫度的升高而減小。當(dāng)溫度為35℃時，最大比生長速率μm最大，鹵雞腿中大腸桿菌最適生長溫度為35℃。而當(dāng)溫度為20℃時，延滯時間λ 最長且比生長速率μm最小，因此適當(dāng)降低貯存溫度可有效防止大腸桿菌的生長繁殖。

表2 大腸桿菌的生長參數(shù)

2.2 溫度對大腸桿菌生長動力學(xué)參數(shù)的影響

溫度對微生物的生長動力學(xué)影響需要用二級方程平方根方程進(jìn)行描述，見表3。

表3 大腸桿菌平方根二級方程及相關(guān)系數(shù)

根據(jù)Belehradek 方程擬合不同溫度條件下最大比生長速率(μm)和延滯時間(λ)得出曲線做圖。由圖1、圖2 可知，大腸桿菌最大比生長速率μm 隨溫度的上升逐漸增大，溫度與最大比生長速率的平方根之間線性相關(guān)。延滯時間隨溫度的上升逐漸減小，溫度與延滯時間倒數(shù)的平方根之間線性相關(guān)。從擬合曲線的相關(guān)系數(shù)可以看出，溫度與生長速率的擬合度總體上優(yōu)于溫度與延滯時間的擬合度。

圖1 溫度與最大比生長速率μm的關(guān)系

圖2 溫度與延滯時間λ 的關(guān)系

2.3 大腸桿菌生長動力學(xué)模型的驗證和評價

本研究采用偏差因子(Bf)和準(zhǔn)確因子(Af)來評價已經(jīng)建立的大腸桿菌的生長動力學(xué)模型。應(yīng)用建立的修正Gompertz 模型求得20℃、25℃、30℃、35℃、40℃貯藏時的預(yù)測值，與試驗中實際測得的大腸桿菌數(shù)值進(jìn)行比較，由大腸桿菌的預(yù)測值和實測值來計算預(yù)測方程的偏差因子(Bf)和偏差因子(Af)，結(jié)果見表4。

表4 不同溫度下大腸桿菌預(yù)測值的偏差因子和準(zhǔn)確因子

偏差因子衡量預(yù)測值是否過高或過低估計了實測值，表示模型的結(jié)構(gòu)偏差。準(zhǔn)確因子衡量預(yù)測值與實測值的平均誤差［8］。Ross［12］建議病原性細(xì)菌Bf的范圍在0.9—1.05 為最好;0.70—0.90 或1.06—1.15 能夠接受;Bf＜0.70 或者＞1.15 不能接受。Lebert［13］認(rèn)為，Bf不能提供全面的模型準(zhǔn)確性預(yù)測，Af顯示預(yù)測值與觀測值的接近程度，Af越接近1，模型越好。表4 說明建立的預(yù)測模型Af和Bf都接近于1，在可接受范圍內(nèi)。表4中偏差因子在1.000—1.025 之間，準(zhǔn)確因子在1.017—1.069 范圍內(nèi)，表示誤差比較低，說明建立的修正Gompertz 模型能夠很好的預(yù)測大腸桿菌20℃—40℃下在鹵雞腿中的生長動態(tài)。

3 結(jié)論與討論

本研究利用修正的Gompertz 方程建立了20℃、25℃、30℃、35℃、40℃條件下大腸桿菌在鹵雞腿中的生長曲線，結(jié)果表明，隨著貯藏溫度的升高，生長速率總體上里上升趨勢。在20℃，大腸桿菌生長較緩慢，μm值較低，隨著溫度升高μm逐漸增大，延滯時間λ 隨溫度的升高而減小;在35℃條件下，雞腿中大腸桿菌生長速率最高。本實驗計算的偏差因子和準(zhǔn)確因子接近1，修正Gompertz 模型能夠較好地預(yù)測20—40℃貯藏溫度下大腸桿菌在鹵雞腿中的生長動態(tài)。本文應(yīng)用平方根方程(Belehradek 方程)建立了鹵雞腿中大腸桿菌隨溫度變化的動力學(xué)模型，包括最大比生長速率和延滯時間的預(yù)測模型，得出最大比生長速率隨溫度的上升逐漸增大，溫度與最大比生長速率的平方根之間線性相關(guān)的結(jié)論。溫度與生長速率的擬合度線性相關(guān)性較優(yōu)于溫度與延滯時間的擬合相關(guān)性。

姜英杰等［14］報道，大腸桿菌在7—16℃生豬肉中生長狀態(tài)適合用修正的Gompertz 模型擬合，溫度對最大比生長速率和遲滯時間的影響適合用Belehradek 方程擬合。唐艷等［15］報道，鮐魚中大腸桿菌在8℃條件下用Gompertz 模型擬合度高，在12℃、16℃條件下用Logistic模型擬合度高，8—16℃條件下二級生長模型可以采用平方根模型進(jìn)行擬合。張輝［4］研究發(fā)現(xiàn)，利用修正的Gompertz 模型能夠很好地描述鹵牛肉中食源性大腸桿菌在10℃、18℃、25℃、35℃貯藏條件下的生長動態(tài)，二級平方根模型擬合程度高。本研究結(jié)論與以上報道結(jié)論相近，對于4—20℃貯藏條件下鹵雞腿中大腸桿菌的生長曲線需要進(jìn)一步研究。

［1］Newell D G，Koopmans M，Verhoef L，et al.Food-borne diseases-the challenges of 20 years ago still persist while new ones continue to emerge ［J］.International Journal of Food Microbiology，2010，139:3-15.

［2］姬華，張玫，盧士玲，等.食源性大腸桿菌耐藥性與毒力特征的研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2014，35(7):364-367.

［3］McMeekin T A，Ross T.Predictive microbiology:providing a knowledge-based framework for change management.Int J Food Microbiol，2002，78(1-2):133-153.

［4］張輝，楊振泉，趙雋，等.食源性大腸桿菌在即食食品中的生長預(yù)測模型［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，27(5):1122-1127.

［5］中華人民共和國衛(wèi)生部中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 4789.2-2010 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗-菌落總數(shù)測定［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［6］王軍，董慶利，丁甜.預(yù)測微生物模型的評價方法［J］.食品科學(xué)，2011，32:268-271.

［7］姬華.對蝦中食源性弧菌預(yù)測模型建立及風(fēng)險評估［D］.江蘇無錫:江南大學(xué)食品學(xué)院，2012.

［8］紀(jì)瑩.傳統(tǒng)米制松糕的貨架期預(yù)測模型研究［D］.江蘇無錫:江南大學(xué)食品學(xué)院，2008.

［9］李除夕，董明盛，陳曉紅，等.豆腐中庫特氏菌生長動力學(xué)模型和貨架期預(yù)測［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2009，25(S):82-86.

［10］Ratkowsky D A，Olley J，McMeekin T A，et al.A relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures ［J］.J Bacteriol，1982，149(1):1-5.

［11］Ross T.Indices for performance evaluation of predictive models in food microbiology ［J］.J Appl Microbiol，1996，81:501-508.

［12］Ross T.Meat and Livestock，Predictive food microbiology models in the meat industry (MSRC.003) ［M］.Sydney，Australia，1999:196.

［13］Lebert I，Robles-Olvera V，Lebert A.Application of polynomial models to predict growth of mixed cultures of Pseudomonas spp.and Listeria in meat ［J］.Int J Food Microbiol，2000，61(1):27-39.

［14］姜英杰，鄒曉葵，彭增起.大腸桿菌在豬背最長肌上生長預(yù)測模型的建立［J］.食品科學(xué)，2008，29(12):115-119.

［15］唐艷，黃薇，張賓，等.鮐魚中大腸桿菌生長預(yù)測模型的建立［J］.食品科技，2012，37(5):313-316.