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不同立地條件下不同竹林土壤微生物特性1)

2015-03-10 03:11許秀蘭楊春琳劉應(yīng)高夏海洋白燕
關(guān)鍵詞:竹種竹林養(yǎng)分

許秀蘭 楊春琳 劉應(yīng)高 夏海洋 白燕

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué),雅安,625014) (重慶姜家鎮(zhèn)派出所) (四川富順林業(yè)局)

不同立地條件下不同竹林土壤微生物特性1)

許秀蘭 楊春琳 劉應(yīng)高 夏海洋 白燕

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué),雅安,625014) (重慶姜家鎮(zhèn)派出所) (四川富順林業(yè)局)

采用平板稀釋法對(duì)不同立地條件的3種竹林土壤微生物進(jìn)行分離,并結(jié)合PCR-DGGE技術(shù),對(duì)土壤細(xì)菌的多樣性進(jìn)行分析。測(cè)定土壤理化性質(zhì)和微生物量碳,對(duì)土壤微生物特征與土壤養(yǎng)分之間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示,3個(gè)樣地土壤細(xì)菌數(shù)量在3種竹林土壤微生物區(qū)系中達(dá)90%以上,均占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。宜賓地區(qū)微生物數(shù)量和細(xì)菌多樣性最高,瀘州的梁山慈竹最低。3個(gè)地區(qū)竹林微生物量碳在秋冬季均顯著高于春夏季,與植物的生長(zhǎng)狀況息息相關(guān)。相關(guān)性分析表明,土壤中3大微生物數(shù)量和細(xì)菌多樣性均與土壤有機(jī)質(zhì)之間呈顯著正相關(guān),其中土壤細(xì)菌與土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮含量之間關(guān)系最為密切,說(shuō)明土壤微生物對(duì)土壤肥力有一定的指示作用。

竹林土壤;土壤微生物;微生物量碳;細(xì)菌多樣性

We isolated the soil microorganisms with dilution flat plate counting method, and measured the diversity of preponderant group of bacteria using PCR-DGGE technology. We also measured the characteristics of soil and soil microbial biomass carbon, and analyzed correlation between the microorganisms and soil properties. The bacteria had an absolute advantage in the soil microbiota, and the diversity of soil bacteria in different bamboo ecosystem wereP.heterocycla>B.pervariabilis×D.grandis>D.farinosus. The microbial biomass carbon in autumn and winter was significantly higher than that in spring and summer, which showed a closely relation with the growth of plants. By correlation analysis, three groups of the soil microorganisms and bacterial diversity were positive correlated with the soil organic matter. Moreover, the bacterial diversity had positive correlation or significantly positive correlation with the organic matter and alkaline hydrolysis nitrogen in the soil. Soil microbial could be regarded as an indicator to reflect the soil fertility with has great application potential.

土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中發(fā)揮著決定性作用,目前常以土壤微生物結(jié)構(gòu)與功能的多樣性等方面的研究作為評(píng)價(jià)退化生態(tài)系統(tǒng)中生物群系與恢復(fù)功能之間的關(guān)系[1]。土壤微生物主要分布在0~20 cm的土層中,隨著土層的加深微生物數(shù)量迅速減少,并在季節(jié)分布上表現(xiàn)出差異性[2]。目前關(guān)注較多的是植被類型或植物不同品種與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性的關(guān)系[3-4]。研究土壤微生物群落與植被多樣性之間的相互影響對(duì)于揭示微生物、環(huán)境和植物之間的關(guān)系意義重大。黃元元等[5]研究不同演替階段植被類型土壤微生物群落特征時(shí)指出,植被主要通過(guò)土壤全磷和有機(jī)質(zhì)影響微生物代謝功能多樣性。

梁山慈竹(Dendrocalamusfarinosus)和撐×綠雜交竹(Bambusapervariabilis×Dendrocalamopsisgrandis)是重要的叢生型筍材兩用經(jīng)濟(jì)竹種,毛竹(Phyllostachysheterocycla)則為重要的散生型兩用經(jīng)濟(jì)竹種。其中梁山慈為四川南部重要的鄉(xiāng)土竹種之一,而撐×綠雜交竹則為多年育種培育出來(lái)的雜交新品種,毛竹是南方最主要的經(jīng)濟(jì)竹種。因3竹種在生長(zhǎng)和材質(zhì)上的優(yōu)點(diǎn)而成為了四川地區(qū)主要的竹林組成種。本研究選擇的試驗(yàn)對(duì)象為四川地區(qū)的3種優(yōu)勢(shì)竹種,對(duì)其四季的土壤微生物組成以及微生物量碳等方面進(jìn)行了研究,旨在掌握竹林土壤微生物的分布特征,為竹林經(jīng)營(yíng)和管理提供科學(xué)的基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)采樣地位于四川省梁山慈竹采自瀘州市敘永縣水尾鎮(zhèn)(N28°10′~28°28′,E105°28′~105°48′)。該地區(qū)氣候溫暖濕潤(rùn),年均溫度約18 ℃,年無(wú)霜期300 d以上,土壤類型為紫色土。撐×綠雜交竹設(shè)在雅安市隴西鄉(xiāng)(N30°2′~30°3′;E103°0′~103°2′),年均氣溫約15 ℃,年無(wú)霜期300 d以上,林地土壤為紫色土。毛竹采自宜賓市蜀南竹海(N28°29′~28°30′;E105°3′~105°4′),該地區(qū)年均氣溫在16 ℃,年無(wú)霜期300 d以上,土壤類型為黃壤土。其他樣地情況見表1。

表1 樣地基本情況

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 研究方法

2.1 樣品采集

采樣時(shí)間以1 a為周期,分別在1、5、8和11月進(jìn)行4次采樣。在每個(gè)研究區(qū)設(shè)置3個(gè)10 m×10 m樣地,按S形布點(diǎn)取10個(gè)樣點(diǎn),采取0~30 cm土層混合均勻后裝入無(wú)菌聚乙烯袋(鮮土樣約500 g),貼上標(biāo)簽并使用冰袋保存,盡快帶回實(shí)驗(yàn)室分析測(cè)定。無(wú)菌條件下,挑除小石塊與可見根系,過(guò)2 mm篩。過(guò)篩土樣均分3份,一份風(fēng)干后研磨、過(guò)篩以測(cè)定土壤理化性質(zhì);另一份放于無(wú)菌塑料袋于冰箱中4 ℃保存,用于土壤微生物的分離和微生物量測(cè)定;最后一份土樣存于冰箱中-20 ℃保存,用于土壤總DNA分析。

2.2 土壤基本理化性質(zhì)測(cè)定

土壤理化性質(zhì)的測(cè)定參考森林土壤分析方法(中華人民共和國(guó)林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LY/T1213~1239—1999)[6]。

測(cè)定指標(biāo):土壤含水量(烘干法)、土壤pH值(電位法)、土壤有機(jī)質(zhì)(重鉻酸鉀法氧化法—外加熱法)、土壤全氮(半微量凱氏定氮法)、土壤堿解氮(堿解—擴(kuò)散法)、土壤速效鉀(乙酸銨浸提—火焰光度法)、土壤有效磷(乙酸銨浸提—原子分光光度計(jì)法)。

2.3 土壤微生物數(shù)量測(cè)定

土壤微生物量的測(cè)定采用稀釋平板法[7]。秤取10 g新鮮土樣,加入含有90 mL無(wú)菌水的250 mL三角瓶中(內(nèi)附玻璃珠),振蕩15 min后靜置30 s使土樣均勻分散,此為菌懸液原液。按10倍稀釋法將原液分別制備成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍數(shù)的土壤懸液。由于土壤中不同的微生物類群的含量差異,細(xì)菌分離時(shí)采用懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為10-3~10-5,真菌采用10-1~10-3,放線菌為10-2~10-4。吸取100 μL土壤懸液分別涂布于真菌、細(xì)菌和放線菌分離培養(yǎng)基,每個(gè)濃度重復(fù)3次。細(xì)菌培養(yǎng)溫度為37 ℃,培養(yǎng)2~3 d,真菌培養(yǎng)溫度為25 ℃,培養(yǎng)3~5 d,放線菌培養(yǎng)溫度為30 ℃,培養(yǎng)5~7 d。培養(yǎng)一定時(shí)間后,計(jì)算培養(yǎng)皿上出現(xiàn)的菌落個(gè)數(shù)。

土壤中微生物密度=平均每皿菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/干土質(zhì)量。

2.4 土壤微生物量碳測(cè)定

土壤微生物量碳(MBC)的測(cè)定采用熏蒸-浸提法,具體操作見參考文獻(xiàn)[8]。

(1)

土壤微生物量碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)=2.64×EC。

(2)

式中:V0為滴定空白所消耗的FeSO4溶液體積(mL);V為滴定土壤浸提液消耗的FeSO4溶液體積(mL);M為FeSO4溶液的濃度(moL·L-1);f為稀釋倍數(shù);W為烘干土質(zhì)量(g);EC為不熏蒸與熏蒸土壤有機(jī)碳的差值。

2.5 土壤細(xì)菌多樣性分析

2.5.1 土壤總DNA的提取和擴(kuò)增

土壤總DNA的提取按照Hu[9]的方法進(jìn)行。將土壤總DNA溶液用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),并采用上海生工的UNIQ-10柱式膠純化試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行純化。細(xì)菌的PCR擴(kuò)增采用的是16SrDNA基因中的V3區(qū)特異引物518 r(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)和341f(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)。擴(kuò)增條件設(shè)置:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性50 s,54 ℃退火50 s,72 ℃延伸70 s,共30個(gè)循環(huán);最后于72 ℃延伸10 min。

2.5.2 變性梯度凝膠電泳(DGGE)及圖譜分析

DGGE的操作步驟:每孔的上樣量為25 μL(20 μL PCR產(chǎn)物+5 μL上樣緩沖液),先50 V電壓進(jìn)行預(yù)電泳30 min,再用160 V電泳330 min,電泳結(jié)束10 min后,將玻璃板取出染色。用10%的乙酸溶液固定10 min,使用去離子水漂洗3次,再置于振蕩器上用0.2%的硝酸銀溶液染色20 min,并快速用去離子水洗滌5~10 s,接著使用2.5%的無(wú)水碳酸鈉溶液顯影,最后用10%的乙酸溶液終止反應(yīng)。DGGE指紋圖譜用Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

圖譜分析:觀察各土壤樣品中的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性凝膠電泳分離后得到的電泳圖譜,使用Quantity One分析軟件(Bio-Rad)對(duì)各樣品的電泳條帶的多少及其密度進(jìn)行多樣性分析。計(jì)算土壤樣品中的細(xì)菌多樣性指數(shù)(H)和豐度(S)。

H=-∑PilnPi。

(3)

式中:Pi為某個(gè)樣品單一條帶的強(qiáng)度在該樣品中的所以條帶總強(qiáng)度中所占的比率;S為某個(gè)樣品中所有條帶數(shù)目總和。

2.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)借助Excel 2007和SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)處理,采用LSD法對(duì)數(shù)據(jù)間進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)及相關(guān)性分析,借用origin 8.5作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤微生物的組成

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的基本組成部分,微生物群落結(jié)構(gòu)的組成和數(shù)量是維持土壤健康的重要因素。細(xì)菌、真菌和放線菌是土壤微生物的3大類群,在土壤養(yǎng)分的循環(huán)和礦物分解中發(fā)揮著積極的作用[10]。在3個(gè)樣地的竹林土壤中(表2),細(xì)菌數(shù)量最多,占土壤微生物總量的91.24%~92.81%,居于主導(dǎo)地位。放線菌所占比例次之,為6.61%~8.05%。而真菌的數(shù)量最少,僅為微生物總量的0.53%~0.70%。土壤中3大微生物的數(shù)量均表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性動(dòng)態(tài)(表2),細(xì)菌和放線菌在夏季數(shù)量達(dá)到最大值,冬季則最小。而土壤真菌同樣在夏季達(dá)到最高值,但在冬季出現(xiàn)小幅提升的趨勢(shì)。此外,比較3竹種土壤微生物可以看出,宜賓的毛竹土壤細(xì)菌以及放線菌數(shù)量最高,而雅安的撐×綠雜交竹的真菌則表現(xiàn)出最高。瀘州的梁山慈竹土壤中3大類群微生物數(shù)量均最低。

表2 不同竹林土壤微生物數(shù)量

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

3.2 土壤細(xì)菌的多樣性指數(shù)分析

微生物多樣性變化是表征土壤質(zhì)量狀況的敏感指標(biāo)。通過(guò)分析電泳圖譜(圖1),可以直觀地判斷每個(gè)土壤樣品中細(xì)菌種群數(shù)量的多少,相比傳統(tǒng)的微生物分離鑒定節(jié)約大量時(shí)間。3種竹林下土壤細(xì)菌呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)動(dòng)態(tài),但是變化趨勢(shì)有差異,但不難看出宜賓毛竹土壤細(xì)菌數(shù)量在整體上高于其余兩種竹種。毛竹林四個(gè)季節(jié)土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)(H)由大到小為:夏季、秋季、春、冬季;瀘州梁山慈竹秋季多樣性指數(shù)為大于夏季的、冬季多樣性指數(shù)春季的;雅安撐×綠雜交竹則表現(xiàn)出夏季、冬季、秋季>春季,3種竹林下土壤細(xì)菌均在夏秋季節(jié)相對(duì)更高。而3種竹林土壤細(xì)菌豐度為毛竹(36)>撐×綠雜交竹(24)>梁山慈竹(16)(表3)。

泳道1~4分別為春季、夏季、秋季和冬季土壤樣品。

3.3 土壤微生物量碳(MBC)的動(dòng)態(tài)變化

3種竹林土壤微生物量碳隨著時(shí)間的變化均呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)(表4),即毛竹、梁山慈竹和撐×綠雜交竹下的土壤微生物碳在夏季出現(xiàn)一個(gè)低谷,秋冬季節(jié)又逐漸上升。春夏季竹林土壤微生物量碳極顯著低于秋冬季節(jié)(P<0.01)。其中宜賓毛竹林下土壤的微生物碳量相對(duì)高于其他兩竹種,且四季之間的變化差異明顯。

表3 3竹林土壤樣品DGGE電泳條帶豐度及多樣性指數(shù)

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列不同字母表示同一竹種不同季節(jié)的土壤細(xì)菌多樣性及豐度在0.05水平上差異顯著。

表4 不同季節(jié)土壤微生物量碳質(zhì)量分?jǐn)?shù) mg·g-1

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

3.4 土壤微生物特征與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性

如表5所示,土壤微生物特征與土壤養(yǎng)分之間表現(xiàn)出一定的相關(guān)性。在土壤3大微生物類群中,真菌和細(xì)菌的數(shù)量與土壤養(yǎng)分之間的相關(guān)性密切。土壤有機(jī)質(zhì)和土壤細(xì)菌、土壤真菌、土壤放線菌數(shù)量及細(xì)菌多樣性指數(shù)之間表現(xiàn)出顯著正相關(guān)(P<0.05)。有機(jī)質(zhì)表征著土壤肥力,他們之間的相關(guān)性可說(shuō)明土壤的肥力影響著土壤微生物的活動(dòng),或者可以說(shuō)是土壤微生物的代謝活動(dòng)為土壤肥力的保持提供了保障。其次,3種竹林土壤中的細(xì)菌和堿解氮之間還表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)(P<0.01)或者顯著正相關(guān),而其他特征之間的相關(guān)性不明顯。此外,3種竹林土壤生態(tài)系統(tǒng)中的微生物量碳與土壤養(yǎng)分之間的相關(guān)性并不明顯。

表5 土壤微生物特征與土壤養(yǎng)分之間的相關(guān)性

注:*為在0.05水平顯著相關(guān),** 為在0.01水平極顯著相關(guān)。

4 結(jié)論與討論

土壤是微生物的天然培養(yǎng)基,細(xì)菌、真菌和放線菌3大類群微生物積極參與土壤養(yǎng)分的循環(huán),表征著土壤的生物活性。細(xì)菌在土壤無(wú)機(jī)物和有機(jī)物的轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著重要作用;真菌主要參與有機(jī)質(zhì)的分解,可將枯落物中的蛋白質(zhì)分解成植物可吸收利用的可溶性N、氨基酸和銨鹽等小分子物質(zhì);放線菌也可參與一些較難分解的植物或者動(dòng)物組分,形成腐殖質(zhì)并轉(zhuǎn)化為土壤中的有機(jī)成分[11]。3種竹林生態(tài)系統(tǒng)中,均表現(xiàn)出細(xì)菌數(shù)量的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[10]和細(xì)菌的多樣性[12],且在宜賓毛竹土壤中,細(xì)菌、放線菌的數(shù)量和細(xì)菌多樣性。此外,微生物量碳均也高于其他兩地的兩竹種。這樣的優(yōu)勢(shì)與多樣性對(duì)土壤養(yǎng)分有效化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)起著重要作用。土壤微生物的分布與土壤養(yǎng)分息息相關(guān),用土壤微生物相關(guān)指標(biāo)來(lái)反映土壤肥力具有較大的應(yīng)用潛力[13-14]。土壤養(yǎng)分為微生物提供能量來(lái)源的同時(shí)也要依靠土壤微生物的轉(zhuǎn)化而得到實(shí)時(shí)補(bǔ)充,所以微生物和土壤質(zhì)量之間存在復(fù)雜的相互作用。張瑞等[15]研究得出,有機(jī)肥的添加有利于土壤微生物代謝活性和微生物群落功能的多樣性。本試驗(yàn)相關(guān)分析表明,細(xì)菌數(shù)量與土壤有機(jī)質(zhì)和堿解氮含量之間的相關(guān)性最為密切,其次為真菌。可見,土壤中的細(xì)菌對(duì)土壤養(yǎng)分變化較為敏感,細(xì)菌群落的變化影響土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化以及植物的生長(zhǎng)。

土壤微生物群落特征與森林群落、土壤類型、可利用營(yíng)養(yǎng)成分以及pH值等有著直接聯(lián)系[16]。土壤微生物量可反映參與調(diào)控土壤中能量和養(yǎng)分循環(huán)以及有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的微生物數(shù)量[17]。3種竹林土壤中,在秋冬季節(jié)的微生物量碳處于相對(duì)較高的水平,這與樸春河和王國(guó)兵等[18-19]人的研究結(jié)果一致,均表現(xiàn)為植物生長(zhǎng)旺盛時(shí)期土壤微生物量低,休眠時(shí)期則升高。此外,黃靖宇等研究發(fā)現(xiàn)植物根系對(duì)土壤中碳、氮的吸收與微生物對(duì)碳、氮的需求是一種競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系,植物對(duì)土壤中碳、氮的需求越大,土壤微生物量碳、氮的值就越小[20]。在3種竹林生態(tài)系統(tǒng)中,微生物量碳和土壤微生物數(shù)量幾乎表現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)。在春、夏季節(jié),竹子生長(zhǎng)旺盛,土壤養(yǎng)分多供植物生長(zhǎng)所需,在營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)中微生物處于劣勢(shì);同時(shí),夏季干濕的土壤環(huán)境加快土壤微生物量向可溶性有機(jī)碳的轉(zhuǎn)換,并不斷消耗微生物量碳而使其降低[18],秋冬季節(jié)則相反。然而,土壤微生物生物量碳的變化規(guī)律及其調(diào)控機(jī)制還需深入研究。

傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法只能對(duì)可培養(yǎng)微生物進(jìn)行研究,PCR-DGGE技術(shù)的發(fā)展可以更全面的反映土壤微生物群落的真實(shí)信息。在土壤生態(tài)系統(tǒng)中,蘊(yùn)含著豐富的微生物資源,對(duì)竹林土壤中的微生物資源進(jìn)行系統(tǒng)的研究,不僅有利于對(duì)植物生長(zhǎng)的土壤環(huán)境進(jìn)行較多的微觀了解,更有助于土壤微生物資源的開發(fā)利用。

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Characteristics of Soil Microorganisms in Three Bamboo Ecosystems

Xu Xiulan, Yang Chunlin, Liu Yinggao(Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, P. R. China); Xia Haiyang(Jiangjia Police Station of Banan District); Bai Yan(County Forestry Bureau)/Journal of Northeast Forestry University,2015,43(2):51-54,58.

Bamboo forest soil; Soil microorganism; Microbial biomass carbon; Bacterial diversity

1) 國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BADC2B01)。

許秀蘭,女,1986年1月生,四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,博士研究生。E-mail:xuxiulanxxl@126.com。

劉應(yīng)高,四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,教授。E-mail:lyg927@263.net。

2014年7月1日。

S154.3

責(zé)任編輯:潘 華。

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