韓瑞芳，曹艷萍，王若珩，張凌燕

(1.西北政法大學公安學院,陜西西安710063)

(2.西南政法大學刑事偵查學院,重慶401120)

0 引言

殼聚糖是天然生物高分子甲殼素的衍生物，具有無毒且可以成膜等許多優(yōu)良性質(zhì)，而該分子中含有豐富的氨基，其與納米金之間有很強的親和力，故被廣泛用于傳感器中制備電極[1]。

亞硝酸鹽是肉制品及其它食品加工過程中常用的一種食品添加劑。此外，在泡菜及不新鮮的食物中也容易出現(xiàn)亞硝酸鹽。食品中亞硝酸鹽含量超過國家標準，就會導(dǎo)致食物中毒。由于亞硝酸對人體的危害，其檢測受到全世界的重視。近些年來，國內(nèi)外研究工作者利用電流型傳感器對其進行檢測的報道明顯增多。國外主要選用特異性亞硝酸鹽還原酶，Silveira.C.M 小組[2]為其代表，他們選用多媒體細胞色素c 和亞硝酸還原酶[3-6]，Almeida.M.G 小組、Davis.J.J 小組等[7-8]用含銅型亞硝酸鹽還原酶，C.C.Rosa 小組[9]則用細胞色素cd1 亞硝酸鹽還原酶[10-11]作為亞硝酸鹽特異性識別元素。國內(nèi)的研究則主要集中在用非特異性蛋白如血紅蛋白[12]、肌紅蛋白[13-14]或細胞色素c[15]作為生物識別元素檢測亞硝酸鹽，而西南大學的袁若小組[16]則利用鑭–多壁納米碳管等具有催化性能的納米材料作為識別元素檢測亞硝酸鹽，該傳感器由于無酶或蛋白質(zhì)，傳感器穩(wěn)定性顯著提高。

該文采用帶豐富氨基的殼聚糖(CS)分散納米碳(Nano-C)后將其滴加于電極上，利用其氨基吸附納米金(Nano-Au)，從而制備了無生物物質(zhì)標記且無電子媒介體的亞硝酸鹽傳感器：(1)該傳感器制備及反應(yīng)過程中無電子媒介體，故無電子媒介體滲漏、富集等不良問題，進一步提高了電極穩(wěn)定性；(2) 該傳感器在反應(yīng)過程中無生物物質(zhì)，顯著提高了電極的使用壽命；(3) 該傳感器制備簡單，成本低廉。

圖1 電極修飾過程表征圖：(a)裸金電極；(b)CS@Nano-C 修飾的金電極；(c)Nano-Au/CS@Nano-C 修飾的金電極，測試底液0.25 mol/L PBS(pH6.0)+25 μmol/L NO2-Fig.1 CV at a:(a)Au electrode,(b)CS@Nano-C modified Au electrode,(c)Nano-Au/CS@Nano-C modified Au electrode in PBS and NO2-

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

殼聚糖、氯金酸(Sigma 公司)，納米碳(北京德科島金科技有限公司)；檸檬酸三鈉(四川化學試劑廠)。實驗用水為二次蒸餾水。

CHI660A型電化學工作站(上海辰華儀器公司) 三電極系統(tǒng)：Nano-Au/復(fù)合殼聚糖@ 納米碳（Nano-Au/CS@ Nano-C） 修飾金電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極，0.25 mol/L PBS溶液(pH6.0)為測試底液。

1.2 免疫傳感器的制備

取1 mg 殼聚糖和1 mL mol/L 醋酸溶液混合，對其超聲2 h 后，然后取1mg 納米碳加入4 mL 上述殼聚糖溶液中，超聲分散4 h 后得到均勻分散的黑色懸濁液。在已預(yù)處理的金電極(Φ=4.0 mm)表面滴加8 μL CS@Nano-C，在室溫條件下讓其自然干燥，待完全風干后置入Nano-Au(4℃，8 h) 制的Nano-Au/CS@Nano-C 修飾電極，水洗后置于4℃冰箱中保存待用。

2 結(jié)果與討論

2.1 電極自組裝過程的電化學表征

以不同修飾狀態(tài)的電極為工作電極，于0.25 mol/L PBS(pH6.0)測試底液中含25 μmol/L NO2-在0.2～1.2V 范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安測定，所得循環(huán)伏安曲線如圖1所示。圖1a 是裸金電極的循環(huán)伏安曲線圖，圖1b 是CS@Nano-C 修飾金電極的循環(huán)伏安，由于Nano-C 催化性能，電極峰電流明顯增大。當CS@Nano-C 修飾電極吸附Nano-Au后，由于納米金具有良好的導(dǎo)電性，能促進電子的傳遞，故峰電流值繼續(xù)增大(圖1c)。

2.2 NO2-在Nano-Au/CS@Nano-C 修飾電極上的電化學行為

圖2考查了Nano-Au/CS@ Nano-C 修飾電極對NO2-的電催化還原能力。當NO2-濃度分別是0 mol/L，0.9×10-4mol/L，4.0×10-4mol/L時，從圖2a到圖2c，可看出Nano-Au/CS@Nano-C 電極的氧化峰電流顯著增加，這證明Nano-Au/CS@Nano-C 對NO2-有良好的電化學行為。

圖2 Nano-Au/CS@Nano-C 修飾電極在0.25 mol/L PBS(pH6.0)中含不同NO2-的CV 響應(yīng)：(a)0 mol/L，(b)0.9×10-4 mol/L，(c)4.0×10-4 mol/LFig.2 CV response of Nano-Au/CS@Nano-C modified Au electrode in PBS at various NO2-concentrations:(a)0 mol/L,(b)0.9×10-4 mol/L,(c)4.0×10-4 mol/L

2.3 實驗條件優(yōu)化

圖3比較了CS@ Nano-C 與Nano-Au/CS@Nano-C 不同修飾電極對NO2-響應(yīng)的影響。由圖可見，與CS@Nano-C 修飾電極相比，Nano-Au/CS@ Nano-C 電極對NO2-響應(yīng)最好，故選擇Nano-Au/CS@Nano-C 電極為工作電極。

圖3 不同修飾電極在0.25 mol/L PBS(pH6.0)中對NO2-的電流響應(yīng)：(a)CS@Nano-C 修飾電極；(b)Nano-Au/CS@Nano-C 修飾電極Fig.3 Current response of different electrode in PBS:(a)CS@Nano-C modified Au electrode,(b)Nano-Au/CS@Nano-C modified Au electrode

實驗比較了滴加Nano-C 量對電極的影響，發(fā)現(xiàn)若Nano-C 量過多時與電極結(jié)合不牢，Nano-C 膜易脫落，而當Nano-C 量過少，工作電極靈敏度降低。此外，用于分散Nano-C時CS 的濃度也會對電極帶來很大影響，當加入Nano-C 中CS 的濃度過大時，將嚴重阻礙電子傳遞，降低響應(yīng)；而當加入Nano-C 中CS 的濃度較少時，又不利于CS@Nano-C 膜的穩(wěn)定。因此，實驗中Nano-C 在CS 中的含量為0.25 mg/L。

pH 對Nano-Au/CS@Nano-C 電極催化反應(yīng)及其活性有重要影響。該次實驗在酸性及中性環(huán)境內(nèi)檢測了Nano-Au/CS@ Nano-C 電極的電流響應(yīng)，由圖4可知,當pH為6.0時，該修飾電極對NO2-催化效果最佳；當pH為4.0時，該修飾電極對NO2-催化效果最差。其可能的原因是CS 在酸性條件下不穩(wěn)定，易溶于水，而當電極置于中性環(huán)境內(nèi)時，電極反應(yīng)缺少相應(yīng)的質(zhì)子，故電催化變困難，電極的電流響應(yīng)降低。

圖4 Nano-Au/CS@Nano-C 修飾電極在不同pH 測試底液中對NO2-的電流響應(yīng)Fig.4 Current response of Nano-Au/CS@Nano-C electrode in different pH

Nano-Au/CS@ Nano-C 修飾電極對NO2-有良好催化性能，在優(yōu)化條件下，其在NO2-濃度為8.0×10-6～2.0×10-4mol/L 范圍內(nèi)有線性響應(yīng)(圖5)，線性方程y =0.1146x + 0.409，檢測下線2.7×10-6mol/L(S/N=3)，這是因為納米碳有較好的催化性能，而Nano-Au 能促進電子傳遞，二者協(xié)同作用，故電極靈敏度提高。

圖5 Nano-Au/CS@Nano-C 修飾電極在0.25 mol/L PBS(pH6.0)中的動力學響應(yīng)曲線Fig.5 Current response response of Nano-Au/CS@Nano-C modified Au electrode in PBS at various NO2-concentrations

2.4 電極的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、干擾實驗

為了考察該修飾電極的穩(wěn)定性，將Nano-Au/CS@Nano-C 電極置于不含NO2-的測試底液中連續(xù)循環(huán)掃描100 圈后，其電流響應(yīng)信號仍能保持初始信號的97.2%，這證明由于該修飾電極無電子媒介體，電極穩(wěn)定性顯著提高。此外，殼聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)將納米碳穩(wěn)固于電極上，其氨基與Nano-Au 強烈的吸附作用又增加了Nano-Au 的穩(wěn)定性。為了考察該修飾電極的壽命，將該電極置于2～8℃冰箱中放置10 d，在放置期間歇性使用，其響應(yīng)信號稍有變化，但變化量沒有超過初始信號的2.2%。同時制備4 支電極，分別在NO2-濃度為50 μmol/L NO2-下對其進行測定，4 支電極其響應(yīng)電流的相對標準偏差RSD＜4.0%，表明該修飾電極具有良好的重現(xiàn)性。

NO2-在pH6.0 PBS 中，其峰電位在0.8 V，抗壞血酸及多巴胺峰電位分別在0.2 V、1.1 V，而過氧化氫峰電位在-0.7 V。因此，上述常見物質(zhì)均不會對NO2-的檢測產(chǎn)生干擾。

2.5 回收測定

以0.25 mol/L PBS(pH6.0)為測試底液，把標準NO2-配制成不同濃度的待測品，將該工作電極置于待測樣品溶液中各測定3次，測定其電流響應(yīng)變化值，結(jié)果列于表1，該工作電極的回收率從98.0%～103.5%。

表1 該電極的回收結(jié)果(n=3)Tab.1 Recovery of the prepared biosensor(n=3)

3 結(jié)論

該文以殼聚糖分散的納米碳為基底結(jié)合納米金，利用Nano-Au/CS@Nano-C 的直接電催化作用制備了具有催化性能的納米材料作為識別元素檢測亞硝酸鹽的傳感器。該傳感器具有制備簡單、靈敏度高、穩(wěn)定性好、無外加毒性物質(zhì)，且無電子媒介體滲漏、富集等消極問題。

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