王杰　肖政　范里　鄧獻存　劉旭平　譚文松

摘要：近年來，國家食品藥品監(jiān)督管理局基于藥物安全性的考慮對于治療性蛋白的質(zhì)量提出了更高的要求，而蛋白多聚體能引起人體免疫反應(yīng)，被認為是關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQA）。采用培養(yǎng)基組分添加試驗和操作參數(shù)控制試驗的方法，系統(tǒng)研究了培養(yǎng)基中氧化還原物質(zhì)和培養(yǎng)過程參數(shù)（溫度和pH值）對抗體多聚體形成的影響。結(jié)果表明，半胱氨酸的添加能顯著抑制多聚體的形成，培養(yǎng)基中半胱氨酸添加濃度增至30 mmol/L，多聚體含量下降40%。而銅離子的添加濃度從500 μmol/L降至0 μmol/L，多聚體含量則降低了43%。培養(yǎng)溫度從35 ℃降低至32 ℃，重鏈結(jié)合蛋白（BiP）和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）的表達水平均提高了89%，細胞翻譯后修飾能力顯著加強，分泌至上清液中的抗體多聚體含量相應(yīng)下降了38%。研究結(jié)果明確了生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品關(guān)鍵屬性之間的關(guān)系，為后續(xù)設(shè)計優(yōu)化以質(zhì)量為先導的培養(yǎng)過程，生產(chǎn)質(zhì)量可控、安全、有效抗體藥物奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：單克隆抗體；多聚體；氧化還原；操作參數(shù)；培養(yǎng)基組分

中圖分類號：Q943.1 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0029-04

收稿日期：2014-11-24

基金項目：國家自然科學基金（編號：21106045）。

作者簡介：王杰（1987—），女，河北保定人，碩士研究生，研究方向為動物細胞與組織工程。E-mail：ecust12wj@126.com。

通信作者：譚文松，教授，研究方向為動物細胞與組織工程。E-mail：wstan@ecust.edu.cn。21世紀以來，食品藥品監(jiān)督管理局對治療性蛋白藥物安全性和功效性要求不斷提高，質(zhì)量監(jiān)測和控制成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中的研究熱點，美國藥物與食品監(jiān)管局和歐洲藥物局于2004年提出了在所有的藥物開發(fā)生產(chǎn)中補充質(zhì)量設(shè)計（quality by design，QbD）理念[1]。

多聚體含量是蛋白藥物關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）之一，越來越受到人們的關(guān)注。生產(chǎn)過程中形成的蛋白多聚物會影響最終產(chǎn)品安全性和功效性。Rosenberg指出蛋白多聚體是免疫反應(yīng)的強力誘導者，僅10%的多聚體含量就會引發(fā)人的免疫反應(yīng)，甚至導致人的死亡，因此要嚴格控制生產(chǎn)過程中多聚體的形成[2]。

蛋白多聚體是通過共價鍵（例如二硫鍵），或者非共價鍵（靜電作用和疏水作用）的連接形成的[3]?？贵w二硫鍵連接發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化還原電勢將直接影響到抗體二硫鍵的連接。培養(yǎng)過程中的控制參數(shù)（pH值和溫度）已被廣泛證明會影響細胞生理狀態(tài)，影響抗體表達，折疊和翻譯后修飾，Yoon 等報道，降低培養(yǎng)溫度至33.5 ℃，使EPO的比生成速率提高了4倍，使EPO的產(chǎn)量提高了2.4倍[4]。Muthing等報道pH值影響了雜交瘤細胞表達的單克隆抗體的半乳糖和唾液酸的含量[5]?？贵w分泌到胞外后已正確連接的二硫鍵又會被氧化還原物質(zhì)還原和重構(gòu)，形成蛋白多聚體[6]。而為防止因活性氧（reactive oxygen species，ROS）引起的細胞凋亡，培養(yǎng)基中一般均會添加谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸等還原物質(zhì)，這可能會加速蛋白多聚體的形成?；赒bD理念基礎(chǔ)，亟須研究培養(yǎng)過程參數(shù)及培養(yǎng)基組成對蛋白多聚體形成的影響，深入理解多聚體和生產(chǎn)工藝之間的聯(lián)系，建立多聚體與過程參數(shù)的關(guān)系，從而減少最終產(chǎn)品多聚體含量，保證實現(xiàn)質(zhì)量設(shè)計。

我們采用培養(yǎng)基組分添加試驗和操作參數(shù)控制試驗的方法，系統(tǒng)研究了培養(yǎng)基中氧化還原物質(zhì)和培養(yǎng)過程參數(shù)（溫度和pH值）對抗體多聚體形成的影響。研究結(jié)果為后續(xù)在質(zhì)量設(shè)計（QbD）指導下進行工藝開發(fā)提供了數(shù)據(jù)支持，為建立質(zhì)量可控的培養(yǎng)工藝奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1細胞株與培養(yǎng)基

試驗所用細胞株為表達單克隆抗體-A（Mab-A）的CHO細胞。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基均由華東理工大學生物反應(yīng)器國家重點實驗室自主研發(fā)，其中流加培養(yǎng)基由多種氨基酸、維生素以及葡萄糖組成。

1.2培養(yǎng)基組分添加試驗

培養(yǎng)基組分添加試驗分為2組：還原組分添加試驗和氧化組分添加試驗。還原組分添加試驗中，選取了5個常用還原劑谷胱甘肽（GSH）、二巰基蘇糖醇（DDT）、β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）、維生素C以及半胱氨酸（cysteine），具體添加濃度見表1，其中試驗組6為未添加上述還原劑的陰性對照。試驗組1～5設(shè)定的添加濃度均為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加濃度的3～10倍。氧化組分添加試驗選取了CuSO4和胱氨酸這2種氧化劑（表1）。添加Cu2+試驗中添加了不同濃度的銅離子，未添加銅離子作為陰性對照組。添加胱氨酸試驗中的對照未添加胱氨酸。

培養(yǎng)基組分添加試驗采用流加培養(yǎng)方式考察上述培養(yǎng)基添加組分對最終產(chǎn)品多聚體含量的影響。流加培養(yǎng)的具體操作方式如下：將細胞以1×106 個/mL的密度接種于500 mL（Corning，USA）搖瓶內(nèi)，工作體積為150 mL，置于偏轉(zhuǎn)半徑為20 mm的搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速設(shè)置為110 r/min，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為7%的CO2濃度和37 ℃的溫度。每天脈沖2%（體積分數(shù)）的流加培養(yǎng)基以補充因細胞生長及產(chǎn)物合成所損耗的營養(yǎng)物。

1.3操作參數(shù)控制試驗

操作參數(shù)控制試驗主要考察培養(yǎng)溫度和pH值對最終產(chǎn)品多聚體含量的影響，分為溫度控制試驗和pH值控制試驗2部分內(nèi)容。溫度控制試驗選取32.0、33.5、35 ℃ 3個水平，每個水平做4個平行，33.5 ℃為對照組；pH值控制試驗選取68、7.0、7.2等3個水平，每個水平做3個平行，pH值7.0為對照組。操作參數(shù)控制試驗均在2 L生物反應(yīng)器上進行，采用的培養(yǎng)模式為流加培養(yǎng)，具體操作如下：接種細胞密度為1×106 個/mL，工作體積為2 L，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)置為80 r/min，溶氧為40%，pH值采用補加CO2或NaOH控制，溫度和pH值參數(shù)設(shè)置如上所述。

1.4分析方法

1.4.1多聚體含量檢測凝膠排阻色譜（SEC）是檢測單克隆抗體中多聚體含量的通用方法，本方法使用的高效液相系統(tǒng)為Waters 2487 HPLC System （1525 Binary HPLC Pump；717 plus Autosampler；2487 UV Detector，Waters），采用的色譜柱是孔徑為4 μm的TSK-Gel G3000 SWXL （4.6 mm×30 cm，Tosoh Bioscience，Montgomery，PA） 色譜柱。流動相為 20 mmol/L 磷酸二氫鈉、0.2 mol/L氯化鈉緩沖溶液。進樣量為20 μl，檢測波長為280 nm，以0.5 mL/min的流速等度洗脫30 min。

1.4.2BiP mRNA和PDI mRNA相對含量檢測BiP和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）是抗體蛋白翻譯后修飾過程中2個重要的分子伴侶蛋白，直接參與蛋白二硫鍵的形成。BiP mRNA和PDI mRNA含量能間接反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中二硫鍵加工能力。BiP mRNA和PDI mRNA含量通過熒光定量 PCR 測定，以β-actin為內(nèi)參基因，BiP mRNA和PDI mRNA的相對含量由公式（1）計算得到：

X=Xi/Xstd×100%。（1）

式中：X為BiP mRNA或PDI mRNA相對含量，Xi為BiP mRNA或PDI mRNA的含量，Xstd為β-actin mRNA的含量。

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基組分對多聚體形成的影響

2.1.1還原組分對多聚體形成的影響還原組分添加試驗的檢測結(jié)果見表2。半胱氨酸是對多聚體形成影響極顯著（P<0.000 1）。培養(yǎng)基中添加了30 mmol/L的半胱氨酸后，抗體多聚體相對百分含量下降至62%，比對照組下降了近40%。半胱氨酸是氨基酸中唯一一個帶有游離巰基的氨基酸，該游離巰基被認為可以參與蛋白中二硫鍵的交換和還原。Banks等用半胱氨酸對半胱氨酸化水平有差異的抗體進行孵育，發(fā)現(xiàn)半胱氨酸不僅能夠去除抗體的半胱氨酸化，而且能夠減少抗體中多聚體含量，提高抗體穩(wěn)定性[7]?？贵w分子處于鉸鏈區(qū)二硫鍵溶劑暴露性最差，一方面易相互交換形成多聚體，另一方面也容易受游離巰基的攻擊而發(fā)生解離。因此，半胱氨酸的加入可能攻擊了抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵的連接，加速了這部分二硫鍵的還原，促使多聚體轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w，從而顯著減少了多聚體含量。谷胱甘肽、二巰基蘇糖醇、β-巰基乙醇、維生素C在試驗組考察的范圍內(nèi)對多聚體的形成與對照差異不顯著。

2.1.2氧化組分對多聚體形成的影響銅離子不僅是具有強氧化性的化學物，而且會影響線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等重要細胞器的生理功能。銅離子添加濃度對多聚體含量的影響見圖1。銅離子添加濃度與多聚體含量呈正相關(guān)。對照組多聚體的含量為9%，添加25 μmol/L銅離子后，多聚體含量達到108%，比對照增加了20%，添加500 μmol/L銅離子后，多聚體含量最高，達15.8%，比對照增加了76%。Chaderjian等發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加入Cu2+離子后，CHO細胞表達的IgG1的Fab片段上的自由巰基含量顯著減少，說明銅離子在胞內(nèi)介導了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)的合成過程[8]。Cromwell等認為金屬離子會造成蛋白表面局部變性，改變蛋白表面物化特性，增加蛋白聚合的概率[9]。我們推測銅離子一方面影響了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的氧化還原電勢，另一方面引起了培養(yǎng)上清中抗體表面的變性，使某含量（%）1谷胱甘肽150 μmol/L105±3.43300 μmol/L106±1.892β-巰基乙醇4 mg/L97±2.3212 mg/L98±1.653二巰基異糖醇500 μmol/L103±2.451 mmol/L97±2.124維生素C0.1 mmol/L97±2.640.4 mmol/L98±1.175半胱氨酸30 mmol/L62±1.23***6對照～100±3.54注：計算公式為C=Ci/Ccon×100%，式中：Ci表示條件i下的多聚體百分含量，Ccon表示對照組的多聚體百分含量，C代表條件i下多聚體的相對百分含量。以上所有數(shù)值格式均為“平均值±標準偏差”（n=3）。***表示P<0.000 1。

些二硫鍵溶劑暴露性增大，增加了分子間二硫鍵錯配交聯(lián)的幾率，從而導致了二硫鍵的形成。

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入胱氨酸后，產(chǎn)物中多聚體的相對百分含量見表3，添加27 mmol/L胱氨酸使多聚體相對百分含量達到103%，比對照僅增加了3%，與對照處于同一水平。表明，胱氨酸的加入對多聚體的形成并沒產(chǎn)生影響。

2.2培養(yǎng)過程參數(shù)對多聚體形成的影響

2.2.1溫度對多聚體形成的影響溫度是影響細胞代謝和表達的重要參數(shù)，Schatz等將CHO細胞培養(yǎng)溫度降低至 28 ℃，最終抗體的產(chǎn)量提高了38倍[10]。Trummer等將培養(yǎng)溫度降低至 30 ℃時，CHO細胞表達的EPO的唾液酸含量降低了40%[11]。溫度被認為是培養(yǎng)過程中最重要的關(guān)鍵操作參數(shù)之一。培養(yǎng)溫度的降低能顯著降低抗體多聚體的含量（圖2）。培養(yǎng)溫度從35 ℃降低至32 ℃時，蛋白多聚體含量從（6.8±0.38）%減少至（4.2±0.67）%，降低了38%。這與 Rodriguez 等在研究溫度對β-IFN蛋白分泌影響的結(jié)論[12]一致。Wyeth也闡述了降溫操作對降低抗體蛋白多聚體含量的重要性[13]。但Gomez卻發(fā)現(xiàn)33 ℃比37 ℃下抗體的多聚體含量增加4倍到12倍之多[14]，這可能與不同細胞蛋白合成能力和蛋白翻譯后修飾能力的平衡有關(guān)。

我們從蛋白合成能力和蛋白翻譯后修飾能力2個角度深入探討降溫操作對多聚體含量的影響?？贵w比生成速率直接反映了細胞蛋白合成的能力。將每天的抗體產(chǎn)量對IVCC作圖，斜率即為抗體比生成速率。不同溫度條件下Mab-A的比生成速率見圖3，35 ℃條件下抗體的比生成速率為 （12.58±0.15）×10-9 g/（cell·day），32 ℃條件下的比生成速率提高到（20.83±0.34）×10-9 g/（cell·d），比35 ℃增加了0.66倍，可見降溫操作能有效提高細胞蛋白合成能力。我們采用熒光定量PCR的方法檢測了直接參與二硫鍵連接的2個重要蛋白BiP和PDI的轉(zhuǎn)錄水平（圖4），這2個蛋白轉(zhuǎn)錄水平的高低反映了蛋白翻譯后修飾能力的強弱。低溫培養(yǎng)能顯著提高BiP和PDI 的表達水平。與35 ℃相比，CHO細胞在32 ℃條件下培養(yǎng)時BiP和PDI的表達水平均提高了89%。Kou等在研究培養(yǎng)溫度對TNFR-Fc產(chǎn)物比生成速率的影響機制時發(fā)現(xiàn)，降低溫度后，雖然兩者的mRNA表達水平一致，但30 ℃時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)分子伴侶PDI和Bip的表達量卻是37 ℃下的1.8倍，蛋白翻譯后修飾能力提高了2倍[15]。我們推測溫度的降低雖然同時提高蛋白合成能力和蛋白翻譯后修飾能力，但蛋白翻譯后修飾能力的提高高于蛋白合成能力的提高程度，最終獲得的抗體蛋白多聚體含量顯著降低。