黎萍　黃秋偉　彭靖茹　石蘭蓉　李慧敏

摘要：以4個不同木薯品種（SC205、GR3、GR891、GR911）的無菌苗幼葉或帶有腋芽的莖段為試驗材料，研究不同植物生長調節(jié)劑濃度及組合對其胚性愈傷組織誘導的影響，并對其離體保存條件進行了研究。結果表明：2，4-D和毒莠定對4個不同木薯品種的幼葉及腋芽均能誘導出胚性愈傷，誘導能力為GR3最高，其次為SC205。4個品種以幼葉或腋芽為試料，在毒莠定或2，4-D為12 mg/L時（除GR911幼葉、GR891腋芽），誘導效果最佳；相同木薯品種在不同激素組合的誘導條件下，IBA+6-BA濃度為（1.5+0.8）mg/L組合誘導胚性愈傷分化數(shù)量多于單獨使用IBA、6-BA，表現(xiàn)出一定的顯著差異性。在20 ℃條件下，將GR3木薯胚性愈傷組織保存在添加比久（B9）或烯效唑濃度為 6 mg/L 的保存培養(yǎng)基（含 12 mg/L 毒莠定+30 g/L蔗糖+6.5 g/L脂瓊的GD培養(yǎng)基，pH值5.8）中，保存效果最佳，繼代時間延長至80 d。

關鍵詞：木薯；胚性愈傷；離體保存；蔗糖；B9；烯效唑；細胞活力

中圖分類號： Q943.1；S533.043文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0048-04

收稿日期：2014-05-29

基金項目：廣西壯族自治區(qū)自然科學基金（編號：2012GXNSFAA053072）。

作者簡介：黎萍（1966—），女，廣西博白人，農(nóng)藝師，主要從事植物組織培養(yǎng)與快速繁殖研究。Tel：（0771）2539097；E-mail：lipinggx1026@163.com。木薯（Cassava）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）的灌木狀植物，是世界3大薯類作物之一[1]，在我國廣為栽培，主要栽培于熱帶和亞熱帶地區(qū)。木薯的栽培及加工利用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位，目前世界各木薯生產(chǎn)國收集保存的木薯種質已有8 500多份[2]，國內(nèi)主要采用種質資源圃的形式對木薯種質資源進行保存，這種保存方式需要大量的土地和人力資源，成本高，保存數(shù)量有限，且易遭受各種自然災害的侵襲[3]。離體保存技術的迅速發(fā)展[4]，為長期有效地保存木薯種質資源提供了新的有價值的手段，由于其具有省時、省地、省空間和無病蟲害侵害等優(yōu)點，目前正廣泛用于生產(chǎn)實踐的各個領域。有關木薯胚性愈傷組織離體保存的研究較少，因此，筆者以廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所提供的木薯品種為試驗材料，進行了木薯胚性愈傷組織誘導及其離體保存的研究，以期為木薯種質資源的長期離體保存提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試品種供試木薯品種SC205、GR891、GR911、GR3均由廣西木薯研究所、廣西亞熱帶作物研究所提供。

1.1.2試驗儀器主要儀器有電子分析天平、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、紫外可見分光光度計、電熱恒溫培養(yǎng)箱、循環(huán)水真空泵。

1.1.3試劑甲醇、保險粉（Na2S2O4）、氧化三苯基四氮唑（TTC）粉、石英砂、蔗糖、瓊脂、2，4-D、6-BA、IBA、毒莠定、B9、烯效唑等。

1.2試驗方法

1.2.1誘導改良分化培養(yǎng)基配制M1培養(yǎng)基：MS+2 mol/L CuSO4+2%蔗糖+0.3%瓊脂，pH值6.0；M2培養(yǎng)基：M1+12.0 mg/L 6-BA；M3培養(yǎng)基：M1+毒莠定或2，4-D；M4培養(yǎng)基：M1+6-BA/IBA，或M1+6-BA+IBA。

1.2.2無菌外植體獲取取上述4個不同木薯品種無菌苗莖切段在M1培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)擴繁，獲得大量無菌苗備用。

1.2.3腋芽及幼葉的膨大誘導取在M1培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周的無菌苗，切取1.0～1.5 cm帶腋芽的莖段或者幼葉，將其水平放置在M2培養(yǎng)基上，30個/皿，培養(yǎng)溫度26 ℃，每天光照16 h（800～1 000 lx），膨大培養(yǎng)3～7 d，觀察記錄。

1.2.4胚性愈傷組織的誘導2，4-D及毒莠定是2種最常用的誘導胚性愈傷的激素，優(yōu)化激素濃度組合研究中設定2，4-D及毒莠定的濃度梯度均為6、12、14、18 mg/L。在M1中分別添加不同濃度的2，4-D或毒莠定，即為誘導培養(yǎng)基M3。挑取已膨大的芽點（約1 mm）或者從莖尖挑取1～2 mm幼葉，轉移到M3培養(yǎng)基，30個/皿，5皿/處理，26 ℃暗培養(yǎng)。每2 d在體視顯微鏡下觀察胚性愈傷的發(fā)生情況，第4天開始記錄，統(tǒng)計外植體形成初生胚的數(shù)目，計算出胚率。當球形或魚雷形胚出現(xiàn)，則將其轉移、繼代到新鮮M3培養(yǎng)基上備用。

1.2.5體細胞胚的繼代、成熟將M3培養(yǎng)基上誘導獲得的初生胚狀體從培養(yǎng)塊分離、轉移到新鮮的M4上繼代培養(yǎng)，誘導次生胚狀體發(fā)生和增殖，2周繼代1次，建立循環(huán)培養(yǎng)；觀察、統(tǒng)計增殖速率。

1.2.6胚性愈傷組織保存條件的篩選方法選擇由品種GR3腋芽誘導出的顆粒狀胚性愈傷組織，在顯微鏡下用針頭挑出較純化的胚性愈傷，以含有12 mg/L毒莠定、30 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂的GD培養(yǎng)基（pH值5.8）為常規(guī)保存培養(yǎng)基，每20 d繼代1次，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，光照度800～1 000 lx，光照時間12 h/d。

1.2.7離體保存試驗方法

1.2.7.1不同濃度蔗糖處理對木薯胚性愈傷保存的影響將愈傷組織接種在分別附加10、20、30、40、50 g/L蔗糖的GD+12 mg/L 毒莠定+6.5 g/L瓊脂固體培養(yǎng)基中，以添加 25 g/L蔗糖的培養(yǎng)基為對照。

1.2.7.2生長抑制劑處理對木薯胚性愈傷保存的影響將待保存的愈傷組織接種在分別附加2、4、6、8、10 mg/L的B9、烯效唑（S3307）的GD+12 mg/L 毒莠定+6.5 g/L脂瓊+25 g/L 蔗糖固體培養(yǎng)基中，以不附加抑制劑為對照。

不同濃度蔗糖濃度和生長抑制劑處理的愈傷組織均放置在培養(yǎng)溫度20 ℃、光照度1 500～2 000 lx、光照時間12 h/d的條件下，第1次于培養(yǎng)20 d觀察，以后每15 d觀察1次，測定其生長量和細胞活力。

1.2.7.3不同溫度處理對木薯胚性愈傷保存的影響將正常保存接種后的材料分別于0、10、15、20、26 ℃下保存，以 26 ℃ 下正常培養(yǎng)的材料為對照，光照時間和測定內(nèi)容與上述方法相同。

1.2.7.4細胞活力測定方法木薯胚性愈傷細胞活力的TTC法測定參照白寶璋的方法[5]并略有改動。主要步驟如下：（1） 取0.25 mL 0.4% TTC溶液，加9.75 mL乙酸乙酯和少量保險粉于10 mL容量瓶中，充分搖動，以所生成的紅色TTF溶液作為已知母液，取5支10 mL容量瓶，按照表l所給數(shù)據(jù)配制系列濃度溶液，并用甲醇定容。用紫外分光光度計比色，以甲醇作空白對照，檢測波長485 nm，記錄D485 nm值。并以D485 nm值為縱坐標、以TTF的含量為橫坐標，繪制出以甲醇為溶劑的標準曲線，詳見圖1。

（3）將胚性愈傷取出，用循環(huán)水真空泵濾干水分，再用濾紙壓干愈傷水分，放入試管中，加入5 mL甲醇溶液，然后將試管置于35 ℃保溫箱3 h，使愈傷組織完全變白。將紅色提取液移入容量瓶，最后加甲醇，使總量為10 mL，用分光光度計在波長485 nm下比色，以空白對照試驗作參比測出吸光度D485 nm，查標準曲線，求出TTC還原量。

（4）結果計算：愈傷組織活力值[mg/（g·h）]=TTC還原量（μg）/[愈傷組織質量（g）×時間（h）]；生長量（g）=愈傷組織的終質量（g）-愈傷組織接種質量（g）。

2結果與分析

2.12種植物生長調節(jié)劑對誘導幼葉愈傷組織的影響

表2試驗結果表明，2，4-D和毒莠定對4個木薯品種的幼葉均能誘導胚性愈傷。運用DPS v7.05軟件LSD法分析可知，不同木薯品種在相同的誘導條件下，GR3的幼葉誘導胚性愈傷的平均數(shù)量多于SC205、GR891、GR911，說明GR3的幼葉誘導能力最高，其次為SC205，GR891、GR911的誘導能力較差；相同木薯品種在不同激素水平誘導條件下，2，4-D濃度為12、14 mg/L時，除GR911、GR891外，幼葉誘導胚性愈傷的數(shù)量均高于濃度為6、18 mg/L；毒莠定濃度為12、14 mg/L時，幼葉誘導胚性愈傷的數(shù)量高于濃度為6、18 mg/L，而且差異顯著。4個品種中，除GR911在2，4-D為14 mg/L時誘導效果好于12 mg/L外，其余3個品種均在2，4-D為 12 mg/L 時誘導效果最好。綜合2種生長調節(jié)劑在不同濃度下的誘導愈傷效果來看，以幼葉為材料，4個品種均在毒莠定為12 mg/L時的誘導效果表現(xiàn)較好，木薯品種間的基因型對誘導胚性愈傷的能力表現(xiàn)出明顯差異。表22，4-D及毒莠定對4個木薯品種幼葉誘導胚性愈傷的影響激素種類濃度

2.22種植物生長調節(jié)劑對腋芽誘導愈傷組織的影響

表3試驗結果表明，2，4-D和毒莠定對4種木薯栽培品種的腋芽均能誘導出胚性愈傷。運用DPS v7.05軟件LSD法分析可知，不同木薯品種在相同的誘導條件下，GR3、SC205的腋芽誘導胚性愈傷的數(shù)量多于GR891、GR911，與幼葉誘導效果一致。2，4-D和毒莠定在12、14 mg/L 濃度下對4個品種的誘導效果均明顯好于6、18 mg/L，且4個品種均在毒莠定、2，4-D為12 mg/L時誘導效果最好（除GR891）。綜合2種生長調節(jié)劑不同濃度的表現(xiàn)來看，以腋芽為材料，品種間誘導胚性愈傷的能力有較大差異，大致可以分為2組，即GR3、SC205為1組，GR891、GR911為1組，且前1組的誘導效果要明顯好于后1組。表32，4-D及毒莠定對4個木薯品種腋芽誘導胚性愈傷的影響

2.3植物生長調節(jié)劑組合對誘導愈傷組織分化的影響

運用DPS 7.05軟件LSD法對表4試驗結果進行分析可知，除GR891，相同木薯品種在不同激素組合的誘導條件下，IBA+6-BA誘導胚性愈傷分化數(shù)量多于IBA、6-BA，且存在顯著差異；而IBA、6-BA間的差異性不明顯，誘導效果優(yōu)越性排序為 IBA+6-BA>IBA>6-BA。除GR911，相同木薯品種在不同激素水平誘導條件下，IBA濃度為1.5、2.0 mg/L時，誘導胚性愈傷分化數(shù)量的數(shù)量多于1.0 mg/L，表現(xiàn)顯著差異；相同木薯品種在不同激素水平誘導條件下，6-BA濃度為08 mg/L時，誘導胚性愈傷分化數(shù)量多于0.4、1.2 mg/L，表現(xiàn)顯著差異；相同木薯品種在不同激素水平誘導條件下，IBA+6-BA 濃度為（1.5+0.8） mg/L誘導胚性愈傷分化數(shù)量多于（1.5+0.4）、（1.0+0.4） mg/L，差異明顯或顯著。

IBA、6-BA單獨使用均能使木薯4個品種的胚性愈傷發(fā)生不同程度的分化，但二者的組合均比單獨使用時效果明顯提高，說明二者之間具有一定程度的協(xié)同作用。1.5 mg/L IBA+0.8 mg/L 6-BA 的組合誘導4種木薯品種胚性愈傷的分化效果最好。從品種間整體愈傷誘導差異來看，GR3略優(yōu)于SC205，但均明顯優(yōu)于GR911，整體愈傷誘導最差的是GR891，說明不同品種間的差異還是比較明顯的。

2.4不同處理對木薯胚性愈傷保存的生長量及細胞活力的影響

從表5可見，隨著保存時間的延長，各處理組及對照組均表現(xiàn)出生長量增加、細胞活力下降的趨勢，但生長量和細胞活力下降幅度各異，其中生長抑制劑B9、烯效唑濃度均在6 mg/L時表現(xiàn)效果最佳。

在蔗糖濃度低于30 g/L時，隨著蔗糖濃度升高，木薯愈傷組織的周期增殖量總體看來也在增大，添加30 g/L蔗糖的處理，20 d增殖量達到2.04 g，細胞活力值達0.545 mg/（g·h），細胞活力高于對照；而后隨著蔗糖濃度繼續(xù)升高，愈傷組織增殖量反而有所下降，因為愈傷組織不能進行光合作用，完全處于一種異養(yǎng)狀態(tài)，當培養(yǎng)基中的碳源供應不足時，組織長期處于碳饑餓狀態(tài)，生長受阻；當蔗糖濃度繼續(xù)提高時，培養(yǎng)基滲透壓增加，超出一定濃度，愈傷組織吸收水和養(yǎng)分受阻，抑制了生長[6]。

B9能夠提高培養(yǎng)基的滲透壓，從而抑制材料的生長，因此常作為生長調節(jié)物用于緩慢生長保存，本試驗用B9保存也得到了較好的結果，添加6、8 mg/LB9，經(jīng)過50 d保存后，愈傷組織生長量分別達到2.87、2.45 g，細胞活力分別達到0426、0.311 mg/（g·h），細胞活力明顯高于對照；隨著B9濃度繼續(xù)升高，添加10 mg/L B9，對愈傷組織的生長及細胞活力影響明顯，嚴重抑制材料的增殖，并影響到其活力，因此，添加6 mg/L B9有利于提高木薯胚性愈傷組織生長量和細胞活力。

對木薯胚性愈傷組織的保存作用也有影響，效果與B9差異不明顯，說明這2種生長抑制劑均能延緩木薯胚性愈傷保存時間。在培養(yǎng)基中添加6 mg/L烯效唑，保存35 d，愈傷組織生長量為2.36 g，稍低于對照（2.69 g），但細胞活力保持在0.471 mg/（g·h），高于同期對照組的細胞活力。烯效唑濃度提高至10 mg/L 時，僅保存20 d，愈傷組織的細胞活力就下降至0.318 mg/（g·h），稍低于對照，由于愈傷組織的存活受到抑制，因此，添加高濃度的烯效唑不利于愈傷組織的保存。

在木薯愈傷組織保存過程中，溫度具有重要作用。當溫度處于0～10 ℃時，愈傷組織幾乎無法存活，即使轉入常溫也無法生長。繼代20 d后，TTC法測其活力，其活力值很低，僅為0.156 mg/（g·h）（溫度10 ℃），生長量僅為0.54 g，幾乎沒有增殖；在15、20 ℃條件下，雖然愈傷組織生長量增殖不大，但保存50d時，20、26 ℃（對照）處理愈傷組織活力差異很明顯，分別為0.298、0.101 mg/（g·h），保存65 d時，26 ℃處理幾乎沒有細胞能力，20 ℃處理活力仍高，說明20 ℃有利于木薯愈傷組織保存，常溫保存時，在短時間內(nèi)愈傷組織增殖量大，衰老很快，而低溫可以延緩衰老，并降低短時間內(nèi)的增殖量。

3結論與討論

在植物組培中，植物生長調節(jié)劑是影響愈傷組織誘導的重要因素，植物生長調節(jié)劑的種類、濃度以及它們之間的組合影響著愈傷組織的誘導和分化[7]，合適的細胞分裂素和生長素的組合，能促進愈傷組織的形成及分化。何亞文等將木薯NZ188無菌苗莖段接種在MS附加IBA、BA固體培養(yǎng)基上，能誘導出愈傷組織[8]；覃艷等用不同濃度2，4-D和6-BA組合能從木薯腋芽誘導出愈傷組織[9]。席世麗等用不同濃度6-BA和NAA組合能從木薯花藥誘導出愈傷組織[10]。本試驗比較了單獨使用2，4-D、毒莠定、IBA、6-BA及IBA+6-BA組合生長調節(jié)劑對4個不同木薯品種愈傷組織誘導的效果，結果顯示，使用2，4-D、毒莠定濃度為12 mg/L時能從幼葉或腋芽誘導出木薯胚性愈傷組織且效果最好，1.5 mg/L IBA+0.8 mg/L 6-BA的組合誘導4種木薯品種胚性愈傷的分化效果最好，能夠將水浸狀愈傷組織繼續(xù)分化成淺綠色顆粒狀愈傷組織，且品種間差異較明顯。

由表2、表3、表4的結果可以看出，取不同品種的無菌苗幼葉及腋芽為接種材料，在相同的培養(yǎng)基上誘導愈傷組織的差異較大，這種差異反映了不同基因型對相同生長調節(jié)劑或組合的反應不同，而且在本試驗中也反映了同一基因型對不同的生長調節(jié)劑或組合的反應也不同，這可能由材料本身的內(nèi)源激素造成的。而組合1.5 mg/L IBA+0.8 mg/L 6-BA 中的激素配比可能與多數(shù)品種的內(nèi)源激素之間產(chǎn)生協(xié)調關系，因此這個處理對多數(shù)品種愈傷組織的分化最適合。

離體保存成功的關鍵因素之一是使用合適的植物生長抑制劑[11]。在種質資源離體保存過程中，緩慢生長法是通過調節(jié)培養(yǎng)溫度和改變培養(yǎng)基成分來抑制保存材料的生長和延緩材料衰老從而延長繼代時間的1種保存方法[12]。本研究中，經(jīng)單因素試驗比較，得出在20 ℃條件下在常規(guī)培養(yǎng)基（含 2 mg/L 毒莠定+30 g/L蔗糖+6.5 g/L脂瓊的GD培養(yǎng)基，pH值5.8）中添加6 mg/L B9或烯效唑的方法，可將木薯品種GR3胚性愈傷組織的繼代時間延長至80 d，且繼代細胞活力率較高，可作為木薯胚性愈傷離體保存方法之一。

從試驗結果可以發(fā)現(xiàn)，適當?shù)蜏嘏囵B(yǎng)有利于提高木薯胚性愈傷組織的細胞活力。常規(guī)保存（26 ℃）下，培養(yǎng)65 d的木薯胚性愈傷組織完全失活，愈傷老化，呈褐色顆粒狀，而生長量增多；隨著培養(yǎng)溫度的降低，愈傷組織細胞活力增強，適合離體保存方法。該結論與洪森榮等報道降低培養(yǎng)溫度是植物組織培養(yǎng)緩慢生長保存最常用的方法[13]一致 本試驗得出，

溫度在20 ℃時最適合木薯胚性愈傷組織保存的結論。蔗糖是影響木薯胚性愈傷組織生長的關鍵因素，提高蔗糖濃度可增加培養(yǎng)基的滲透壓，使愈傷組織對水分和養(yǎng)分的吸收受阻，從而延緩離體保存材料的生長速度，但在保存后期卻能加劇愈傷組織的褐變，不利于愈傷組織穩(wěn)定保存，因此在保存過程中不宜采用增加蔗糖濃度的方法。本試驗結果表明，蔗糖濃度在30 g/L時有利于木薯胚性愈傷組織的保存。

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