劉房春，張 健，陳衛(wèi)強(qiáng)，王永德，王一凡，齊向前，劉曉程

（天津醫(yī)科大學(xué)心血管病臨床學(xué)院泰達(dá)國際心血管病醫(yī)院心內(nèi)科 300457）

近年來，隨著介入技術(shù)的不斷發(fā)展，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者的救治效果獲得顯著提高，但是，介入治療方法無法逆轉(zhuǎn)壞死的心肌，對終末期心力衰竭的療效差。而干細(xì)胞具有活躍的增殖能力及多向分化潛能，可能替代、修復(fù)或改善受損的心肌組織的生物學(xué)功能，成為心肌梗死治療的“捷徑”，顯示出了良好的應(yīng)用前景[1-2]。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種多潛能干細(xì)胞，已經(jīng)進(jìn)行很多基礎(chǔ)和臨床研究[3-4]。本實(shí)驗(yàn)選用同種異體臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，用導(dǎo)管法經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植，觀察其治療豬心肌梗死的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要儀器、試劑 非嚙齒類動(dòng)物巴馬豬16只，雌雄不拘，體質(zhì)量25～35kg，巴馬豬由泰達(dá)國際心血管病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供[動(dòng)物合格證號：SCXK（滬）2010-0028]。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定[5]。主要試劑和儀器：博奧森公司兔抗vWF抗體（bs-4754R），SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒（SA1022）及DAB顯色試劑盒（AR1022），數(shù)字減影血管造影機(jī)（Philips），7500超聲心動(dòng)圖儀（Philips sonos），Datex-ohmeda 7000呼吸機(jī)（美國），6FJL4.0造影導(dǎo)管及指引導(dǎo)管，導(dǎo)絲，OTW球囊導(dǎo)管（RyujinPlus）。

1.2 同種異體臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、分離及標(biāo)記 由天津昂賽細(xì)胞基因工程有限公司提供。

1.3 心肌梗死模型的制備 術(shù)前8h禁食水，稱體質(zhì)量，按0.1mL／kg陸眠寧Ⅱ號聯(lián)合0.6mg／kg地西泮腹腔注射誘導(dǎo)麻醉，予以丙泊酚（Ⅳ）維持麻醉，氣管插管，呼吸機(jī)正壓輔助呼吸，潮氣量120～224mL·kg-1·min-1，持續(xù)心電圖及血氧飽和度監(jiān)護(hù)。無菌條件下穿刺右股動(dòng)脈，置入動(dòng)脈鞘管，注入肝素3 000U，送入2.0×20mm的球囊至前降支中段第一或第二對角支遠(yuǎn)端，預(yù)適應(yīng)3～5次（如出現(xiàn)室性心律失常，可適當(dāng)延長預(yù)適應(yīng)時(shí)間），每次5～10min后，如無異常，則以2～4個(gè)大氣壓打開球囊堵閉前降支，造影示球囊遠(yuǎn)端血流中斷，持續(xù)90min后，緩慢釋放球囊。堵塞后心電圖示有心肌缺血或梗死改變（T波倒置、ST段抬高、R波波幅降低等）。再次造影觀察血供，血供良好撤除導(dǎo)管，壓迫止血，送返動(dòng)物房，術(shù)后正常喂養(yǎng)，青霉素240萬U／d，連用3d預(yù)防感染。

表1 冠狀動(dòng)脈組和對照組各項(xiàng)指標(biāo)移植前、后比較（±s）

表1 冠狀動(dòng)脈組和對照組各項(xiàng)指標(biāo)移植前、后比較（±s）

＊：P＜0.05，與同組移植前比較；△：P＜0.05，與對照組移植后6周比較；▽：P＞0.05，與同組移植前比較。

項(xiàng)目移植組移植前 移植后6周對照組移植前 移植后6周LV（mm）43.50±2.67 37.00±2.39＊△ 42.14±2.04 44.43±6.88▽EDV（mm）65.63±8.42 56.86±7.63＊△ 67.14±6.01 70.57±8.50▽ESV（mm）24.63±15.34 16.25±6.45＊△ 22.71±5.65 25.57±7.55▽EF（%）60.50±13.36 71.25±8.94＊△ 65.86±8.93 59.71±7.18▽FS（%）32.88±6.96 39.50±6.85＊△ 36.57±4.61 31.29±5.19▽左室心肌梗死面積 22.34±5.83 15.13±3.23＊△ 20.29±4.72 21.43±5.88▽左室梗死質(zhì)量比 21.13±4.16 13.13±3.23＊△ 18.57±2.89 22.85±6.49▽

1.4 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植 心肌梗死模型制備2周后，將造模成功的16只巴馬豬分為兩組，冠狀動(dòng)脈移植組8只：操作過程同建模過程，經(jīng)0.014英寸指引導(dǎo)絲將2.3F（Cordis，USA）微導(dǎo)管送至前降支遠(yuǎn)端，經(jīng)微導(dǎo)管將含肝素的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液（1.0×107個(gè)／頭，規(guī)格20mL：1.0×107個(gè)細(xì)胞）緩慢推注至冠狀動(dòng)脈內(nèi)，注射時(shí)間為10min，肝素生理鹽水沖洗灌注導(dǎo)管2次，復(fù)查冠狀動(dòng)脈造影；對照組8只：注射等量的生理鹽水。

1.5 超聲心動(dòng)圖檢查 分別于術(shù)前、干細(xì)胞移植前和干細(xì)胞移植后6周，由1名有經(jīng)驗(yàn)的超聲醫(yī)師使用Philips Sonos 7500超聲心動(dòng)儀（S3探頭頻率為1.6～3.2mHz）測量超聲心動(dòng)指標(biāo)，測量左室舒張末容積（LVEDV）、左室收縮末容積（LVESV）、計(jì)算射血分?jǐn)?shù)（EF）、短軸縮短率（FS），取3次測量的平均值作為結(jié)果。

1.6 心肌核素顯像檢查 分別于術(shù)前、干細(xì)胞移植前和干細(xì)胞移植后6周，麻醉后送入核素室，用14.8MBq／kg 99mTc-MIBI行心電門控心肌灌注核素顯像。通過Emory Cardiac Toolbox軟件量化灌注質(zhì)量缺損百分比（mass defect percent，MDP）及梗死面積。

1.7 新生毛細(xì)血管測定 心臟石蠟切片vWF相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)染色后，光學(xué)顯微鏡下可見血管內(nèi)皮細(xì)胞呈黃褐色（圖1），以此可觀察毛細(xì)血管密度。每個(gè)標(biāo)本取3張切片，在低倍鏡（×100）下觀察切片全部視野，找到心肌梗死區(qū)后轉(zhuǎn)到高倍鏡下（×200），每張切片隨機(jī)取5個(gè)200倍視野，取平均數(shù)作為測定值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組內(nèi)不同時(shí)段數(shù)據(jù)分析采用配對t檢驗(yàn)，組間比較采用兩兩比較的t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組干細(xì)胞移植前和移植后6周超聲心動(dòng)圖指標(biāo)的測定 對照組治療后6周和治療前比較各項(xiàng)指標(biāo)均無改善（P＞0.05）。移植組治療后6周左室收縮期末內(nèi)徑、舒張末期內(nèi)徑、左室射血分?jǐn)?shù)及短軸縮短率均較治療前有明顯改善（P＜0.05），且與對照組比較亦有明顯改善（P＜0.05）。見表1。

2.2 兩組心肌核素顯像指標(biāo)的測定 對照組治療后6周和治療前比較各項(xiàng)指標(biāo)均無改善（P＞0.05）。移植組治療后6周左室心肌梗死面積、梗死質(zhì)量比均較治療前有明顯改善（P＜0.05），且與對照組比較亦有明顯改善（P＜0.05）。見表1。

2.3 兩組新生血管數(shù)目的比較 兩組豬心肌組織內(nèi)抗vWF抗體免疫組織化學(xué)染色均有陽性（圖1），對照組的新生血管數(shù)目為（10.24±1.71）個(gè)，移植組為（14.71±2.99）個(gè)，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 梗死交界區(qū)毛細(xì)血管vWF多克隆抗體染色（×200）

3 討論

AMI后常發(fā)生左心室重構(gòu)，最終導(dǎo)致頑固性心力衰竭。雖然溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療及冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等治療方法可以挽救瀕死心肌細(xì)胞，但對壞死的心肌細(xì)胞無能為力。Makino等[6]第1次在體外將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成心室肌細(xì)胞，從而利用干細(xì)胞的多向分化潛能為心肌梗死、心力衰竭的治療帶來新的希望[7]。骨髓干細(xì)胞在特定的環(huán)境下可分化為心肌細(xì)胞，改善心功能，大量的基礎(chǔ)和臨床研究證實(shí)了其能改善心肌梗死患者的預(yù)后[8-11]。但是，骨髓干細(xì)胞取材具有有創(chuàng)性、分離機(jī)取材受時(shí)間限制、細(xì)胞分化能力低、細(xì)胞數(shù)量不足等缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是一種來源廣泛、再生能力強(qiáng)、有較強(qiáng)分化潛能、免疫原性低、不誘發(fā)畸胎瘤、無病毒感染風(fēng)險(xiǎn)及倫理問題的干細(xì)胞[12]。近年來已進(jìn)行了很多基礎(chǔ)和臨床研究，引起關(guān)注。

經(jīng)冠狀動(dòng)脈途徑移植干細(xì)胞是將干細(xì)胞經(jīng)導(dǎo)管注入梗死相關(guān)動(dòng)脈的遠(yuǎn)端，干細(xì)胞在環(huán)境的作用下局部經(jīng)微毛細(xì)血管遷移至缺血的心肌中[13]。AMI作為節(jié)段性心肌病，通過經(jīng)導(dǎo)管冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射可以使移植細(xì)胞快速到達(dá)梗死及其周圍組織，使大量的移植細(xì)胞在梗死局部聚集。而且由于AMI后炎癥細(xì)胞的浸潤以及炎性介質(zhì)的釋放，梗死區(qū)及周圍毛細(xì)血管擴(kuò)張通透性升高，有利于干細(xì)胞通過毛細(xì)血管壁進(jìn)入梗死心肌中，所以，此種干細(xì)胞移植方法創(chuàng)傷小、效率較高。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植綠色熒光蛋白標(biāo)記的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞至梗死心肌，6周后檢查可見綠色熒光蛋白標(biāo)記的干細(xì)胞，表明干細(xì)胞在心肌中存活，從而證明經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植是一種有效的移植方法。

本研究顯示，干細(xì)胞移植組的左室收縮末期內(nèi)徑、舒張末期內(nèi)徑、左室射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率較對照組顯著改善，干細(xì)胞移植組的左室心肌梗死面積、左室梗死質(zhì)量比與對照組比較顯著縮小，表明經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠改善心肌梗死后心肌的收縮功能、縮小心肌梗死面積。其可能機(jī)制：（1）干細(xì)胞移植至宿主內(nèi)存活并分化為心肌細(xì)胞，具有心肌細(xì)胞能承擔(dān)的收縮功能。（2）直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，形成新的血管；以旁分泌或自分泌的方式分泌促血管生長的細(xì)胞因子，促進(jìn)血管的生長[14]，改善梗死區(qū)血供，促進(jìn)了心功能的恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示，干細(xì)胞移植組的新生毛細(xì)血管的數(shù)量多于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（3）干細(xì)胞可與宿主細(xì)胞建立電-機(jī)械耦聯(lián)，參與心肌的收縮。（4）干細(xì)胞移植后減輕心肌的纖維化，維持受損心肌的相對完整性，增加瘢痕組織的彈性，限制心室的擴(kuò)張，抑制心室的重構(gòu)，保護(hù)了泵功能。（5）移植后新生的心肌細(xì)胞增加心臟的順應(yīng)性和彈性，改善舒張功能。

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