趙君

摘 要：以鰻鱺魚(yú)皮膠原為材料，通過(guò)交聯(lián)的方法構(gòu)建組織工程角膜載體支架，評(píng)價(jià)其理化性能、組織結(jié)構(gòu)及生物相容性。結(jié)果表明制備的組織工程角膜支架具有良好的理化性質(zhì)，有望用于組織工程角膜的構(gòu)建。魚(yú)膠原的應(yīng)用已涉及生物醫(yī)學(xué)、食品、化妝品等行業(yè)，但在組織工程角膜領(lǐng)域的研究較少，Chien等利用羅非魚(yú)下腳料提純魚(yú)膠原作為載體支架對(duì)角膜的再生進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示支架為兔角膜細(xì)胞提供了良好的生長(zhǎng)和遷移空間，表明魚(yú)膠原可能成為一種新型的組織工程角膜的支架材料。

關(guān)鍵詞：組織工程角膜 載體支架 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白 生物相容性

中圖分類(lèi)號(hào)：R772 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2015）08（c）-0203-02

角膜是位于眼睛最前端的透明組織，覆蓋虹膜、瞳孔及前房。由于角膜位于眼球前面，直接與外界接觸，故易受損傷和感染，致使角膜疾病較為多見(jiàn)，也是致盲的重要原因[1]。目前唯一的治療辦法是進(jìn)行角膜移植術(shù)，但由于捐獻(xiàn)角膜的高度匱乏，絕大多數(shù)患者因無(wú)法得到供體角膜而不能復(fù)明[2-3]。因此，尋求合適的角膜替代品作為角膜移植的供體將具有重大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白由該實(shí)驗(yàn)室分離純化所得。非轉(zhuǎn)染人角膜基質(zhì)（HCS）細(xì)胞系由該實(shí)驗(yàn)室自行建立。DMEM/F12培養(yǎng)液、胰蛋白酶和小牛血清購(gòu)自Gibco公司。噻唑藍(lán)（MTT）、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亞胺（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）購(gòu)自Sigma公司。其它試劑均為分析純。

1.2 組織工程角膜載體支架的制備

將鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白溶于0.5M醋酸中，制備成50 mg/mL的膠原溶液，注入一定的模具中，厚度控制為400 μm，凍干成多孔膠原海綿。膠原海綿用EDC/NHS于4 ℃交聯(lián)12 h，0.1 M Na2HPO4充分清洗除去殘留交聯(lián)劑。

1.3 膠原支架的透明度及透光率

將膠原支架浸泡于PBS中，用濾紙吸除表面多余水分，放置于印有文字的打印紙上，用數(shù)碼相機(jī)在自然光下拍照。膠原支架浸入20%甘油脫水處理后平鋪于96孔板板底，用酶標(biāo)儀檢測(cè)300～800 nm的透光率，每20 nm測(cè)一個(gè)。以加20%甘油的孔為空白對(duì)照。

1.4 膠原支架的組織結(jié)構(gòu)

為檢測(cè)膠原載體支架的組織結(jié)構(gòu)，樣品在4%多聚甲醛中固定，OCT包埋。用冰凍切片機(jī)切成7～10 μm的切片貼在明膠包被的載玻片上，37 ℃烘干12 h。全自動(dòng)染色機(jī)伊紅染色后，光鏡觀察并拍照。

1.5 膠原支架的表面超微結(jié)構(gòu)

膠原載體支架浸入2.5%戊二醛中4 ℃固定24 h。再浸入1%四氧化鋨中固定2 h，用30%～100%的丙酮梯度脫水。經(jīng)過(guò)CO2臨界點(diǎn)干燥，離子濺射儀鉑金噴濺，用掃描電鏡觀察膠原支架表面超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間差異用雙尾T檢驗(yàn)，P< 0.05時(shí)為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 膠原蛋白的SDS-PAGE

膠原的SDS-PAGE結(jié)果（圖1A）顯示，提取的鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白含有兩條不同的α鏈，即α1鏈和α2鏈，同時(shí)可觀察到其二聚體β鏈。該結(jié)果表明提取的魚(yú)類(lèi)膠原蛋白純度較高，符合I型膠原蛋白的特征，且在提取過(guò)程中膠原蛋白并沒(méi)有發(fā)生降解。

2.2 膠原支架的透明度和透光率

膠原支架的外觀和透光率（圖1B）結(jié)果表明，支架表面平整且具有較高的透明度。膠原支架的透光率隨波長(zhǎng)的增加而增大，膠原支架的透光率為88.95±1.28%。

2.3 膠原支架的結(jié)構(gòu)觀察

膠原支架冰凍切片的HE染色結(jié)果（圖2A）表明，經(jīng)EDC/NHS交聯(lián)后的膠原蛋白纖維交錯(cuò)成網(wǎng)，膠原支架呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。膠原支架內(nèi)部孔隙較多且孔隙較為均勻。掃描電鏡結(jié)果（圖2B）顯示了膠原支架表面的超微結(jié)構(gòu)，膠原支架表面致密，膠原纖維緊密排列，孔隙直徑在0.1～1μm之間。

3 討論

該文初步探索了鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白作為一種支架材料，用于角膜組織工程的可行性。以50 mg/mL的鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白凍干成一定形狀的膠原海綿，通過(guò)EDC/NHS交聯(lián)構(gòu)建組織工程角膜載體支架，檢測(cè)膠原支架的理化性質(zhì)及生物學(xué)性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以該文方法構(gòu)建的組織工程角膜載體支架具有良好的透明度，透光率能達(dá)到88.95±1.28%，與正常人角膜的透光率相近。

該文采用凍干后交聯(lián)的方法制備出了膠原載體支架，HE染色和掃描電鏡結(jié)果表明，膠原蛋白相互交聯(lián)形成膠原纖維束，在支架內(nèi)部相互交錯(cuò)排列形成多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞的遷入。以上結(jié)果證明該文所構(gòu)建的膠原支架具有良好的生物相容性，符合組織工程角膜載體支架的要求。

4 結(jié)論

該研究以鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白為材料構(gòu)建了組織工程角膜載體支架，該支架具有良好的透明度和透光率，呈孔隙較均一多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，支架表面致密均一。因此，魚(yú)皮膠原蛋白可以作為一種新材料用于組織工程角膜的研究，且該文構(gòu)建的膠原載體支架可以進(jìn)一步用于組織工程角膜體外構(gòu)建的研究。

（致謝：該課題為山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金（BS2012YY040）資助。）

參考文獻(xiàn)

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