馬 軍，馬 芮，葉佳琪，李麒麟，姜芳燕，曲江勇,2

(1.瓊州學(xué)院 熱帶生物與農(nóng)學(xué)院，海南 三亞 572022；2.煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005)

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紅樹林根際土壤中產(chǎn)三種酶枯草芽孢桿菌的分離鑒定

馬 軍1，馬 芮1，葉佳琪1，李麒麟1，姜芳燕1，曲江勇1,2

(1.瓊州學(xué)院 熱帶生物與農(nóng)學(xué)院，海南 三亞 572022；2.煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005)

從紅樹林根際土壤中分離純化芽孢桿菌,通過生化特征分析篩選出10株疑似枯草芽孢桿菌,產(chǎn)酶能力檢測發(fā)現(xiàn)8株菌同時具備產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶能力,其中三株菌(JCHL-0209,JCHL-0207和LMJ-17)的產(chǎn)酶能力較高,尤其是JCHL-0207菌株的綜合產(chǎn)酶能力最為顯著,結(jié)合16s rRNA基因序列分析確定這三株菌均為枯草芽孢桿菌,這為進一步將其應(yīng)用于生產(chǎn)實踐提供了理論依據(jù).

紅樹林;枯草芽孢桿菌;產(chǎn)酶;16s rRNA基因

0 引言

紅樹林是一種位于熱帶至亞熱帶的特殊生態(tài)系統(tǒng),由于其經(jīng)常周期性受到海水的侵淹,所以土壤兼具海洋和陸地的性質(zhì)卻又不同于海洋和陸地的環(huán)境特點[1-2].大量研究發(fā)現(xiàn)紅樹林具有的獨特生境往往會造就一些獨特的微生物種類,而這些獨特的微生物往往會產(chǎn)生獨特的代謝產(chǎn)物[3].

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，B.subtilis)是芽孢桿菌屬的一種,革蘭氏陽性細菌,其分布廣泛,并且易于分離培養(yǎng).在顯微鏡下,可以觀察到其細菌形態(tài)呈直桿狀,并能在惡劣的環(huán)境條件下產(chǎn)生芽孢,具有較強的環(huán)境抗逆性.據(jù)資料顯示,枯草芽孢桿菌一般能夠產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等十幾種酶類,同時其具有相對安全性,對機體不會產(chǎn)生太大的影響,因此在食品、醫(yī)藥、生物防治、發(fā)酵工業(yè)以及飼料養(yǎng)殖業(yè)等諸多領(lǐng)域都有著非常廣泛的應(yīng)用.

對于枯草芽孢桿菌的鑒定,傳統(tǒng)的分類方法是對其形態(tài)結(jié)構(gòu)進行觀察與分析,然后進行相應(yīng)的生化特征分析,最后參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》中對枯草芽孢桿菌的特征描述進行判斷,但此方法不能確切的說明芽孢桿菌的遺傳進化地位和關(guān)系.基于16s rRNA基因序列比對是目前使用較多的分子鑒定手段,利用芽孢桿菌16s rRNA基因序列的高度保守性可以比較準(zhǔn)確的對芽孢桿菌進行分類與鑒定[4],若再結(jié)合形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化特征將更為準(zhǔn)確的對枯草芽孢桿菌進行系統(tǒng)性的鑒定.

本研究主要是從紅樹林根際土壤環(huán)境中篩選出具有產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶以及纖維素酶三種酶活性的特殊芽孢桿菌,并對該芽孢桿菌進行了生理生化特征分析及16s rRNA基因序列比對,最終確定其為枯草芽孢桿菌,這為進一步研究其應(yīng)用于生產(chǎn)實踐中提供了理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

紅樹林根際土壤樣品采集于三亞市紅樹林生態(tài)系統(tǒng)保護區(qū)(白鷺公園),鹽濃度為35‰.

1.1.2 培養(yǎng)基

促芽孢生長培養(yǎng)基(液體):蛋白胨 10.0 g,酵母膏 3.0 g,可溶性淀粉 3.0 g,硫酸鎂 0.1 g,磷酸二氫鉀 1.5 g,磷酸氫二鈉 2.0 g,去離子水1000 ml,PH 7.4,121 ℃滅菌20 min.

芽孢桿菌分離培養(yǎng)基(固體):蛋白胨 5.0 g,葡萄糖 5.0 g,酵母膏 5.0 g,磷酸氫二鉀 4.0 g,瓊脂粉 18.0 g,去離子水1000 ml,PH 7.4,121 ℃滅菌20 min.

富集培養(yǎng)基(液體):牛肉膏 5.0 g,蛋白胨 10.0 g,氯化鈉 5.0 g,去離子水1000 ml,PH 7.2-7.4,121 ℃滅菌20 min.

LB培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g,氯化鈉10.0 g,酵母粉 5.0 g,去離子水1000 ml,PH 7.4,121 ℃滅菌20 min.

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與篩選

將采集的土壤樣品以1∶9的比例混合到促芽孢生長培養(yǎng)基中,30℃搖床培養(yǎng)過夜,將培養(yǎng)好的菌懸液置于80℃水浴鍋中加熱10min,吸取已經(jīng)進行熱處理的培養(yǎng)液1ml,用無菌水進行梯度稀釋至10-5、10-6、10-7三個濃度梯度,每個梯度重復(fù)3次,通過平板涂布法接種于芽孢桿菌分離培養(yǎng)基上,30℃下培養(yǎng)24-48h.選取適合的平板,挑取單菌落于富集培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)18-24h,培養(yǎng)好后取少量菌液進行革蘭氏染色,革蘭氏染色結(jié)果為陽性的桿狀菌株進行進一步的畫線分離純化,純化后的菌株進行再次革蘭氏染色鑒定,對純的革蘭氏陽性菌株進行保種.

1.2.2 形態(tài)和生理生化特征鑒定

建筑工程造價的特點就是有著非常復(fù)雜多樣的多層性，所以在建筑工程造價動態(tài)管理的落實過程中，就會遇到很多的阻礙因素。調(diào)控建筑工程造價和選取管理的流程是要重點注意的兩個關(guān)鍵的問題，在日常的管理工作當(dāng)中，應(yīng)該把辨別造價，擬定進度和建造的質(zhì)量這三個因素結(jié)合起來去綜合的考慮。選擇建筑工程造價動態(tài)管理最合適的方式，有序的調(diào)節(jié)所消耗的工程的總造價，只有這樣才能使建筑工程的質(zhì)量達到最好，并且還可以節(jié)省成本。

上述分離純化方法獲取疑似芽孢桿菌菌株,根據(jù)革蘭氏染色后菌株形態(tài)學(xué)的特性,初步選取形態(tài)學(xué)特征較為明顯的菌株(革蘭氏陽性、棒狀或短桿狀、有內(nèi)生芽孢)進行生化特征分析.參考《伯杰式細菌鑒定手冊》及相關(guān)文獻資料,選擇接觸酶、糖/醇利用、V-P反應(yīng)、淀粉水解、吲哚形成、明膠液化、纖維素水解、蛋白水解、硝酸鹽、檸檬酸鹽和硫化氫利用實驗作為初步判斷枯草芽孢桿菌的特征性生化指標(biāo)[5-7].

1.2.3 芽孢桿菌產(chǎn)酶能力測定

將初步分離的疑似芽孢桿菌的單菌落分別點種到淀粉酶篩選培養(yǎng)基、CMC-Na纖維素酶篩選培養(yǎng)基和干酪素培養(yǎng)基上,30℃下培養(yǎng)48h,(1)在淀粉酶篩選培養(yǎng)基上滴加盧戈氏碘液,若菌落周圍產(chǎn)生透明水解圈則表明該菌株具有產(chǎn)淀粉酶能力;(2)在CMC-Na纖維素酶篩選培養(yǎng)基上滴加剛果紅水溶液,靜置顯色30min后用蒸餾水洗去多余染液,再加入適量NaCl溶液靜置洗脫30min,最后再用蒸餾水清洗一次.若產(chǎn)生水解圈則表明該菌株具有產(chǎn)CMC纖維素酶能力;(3)在干酪素培養(yǎng)基上的菌落周圍產(chǎn)生透明的水解圈則表明該菌株具有產(chǎn)蛋白酶能力.一般而言,測量的菌落直徑大小(CD)和水解圈直徑大小(HD)的比值(HD/CD)越大,表明菌株產(chǎn)酶能力越強.因此,每株菌株進行至少三次生物學(xué)重復(fù),通過比較HD/CD的比值初步篩選出具有較強產(chǎn)酶能力的菌株[6-7].

1.2.4 細菌16s rRNA基因序列比對分析

使用Axygen細菌基因組DNA提取試劑盒(AXYGEN:AP-MN-BT-GDNA-50),參考試劑盒說明書進行細菌基因組DNA的提取.16s rRNA基因保守序列使用通用引物16s-FP: 5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和16s-RP: 5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'進行PCR擴增[8].50μl反應(yīng)體系:模版DNA 2μl,上下游引物各1.5μl,10×Buffer 5μl,Taq DNA聚合酶 1μl,dNTP 2μl,加無菌水至50μl.PCR條件為94℃預(yù)變性5min,94℃變性1min,55℃退火30s,72℃延伸90s,30個循環(huán).取PCR產(chǎn)物進行目的片段的分離和純化,然后將純化后的DNA片段和pMD 19-T Vector進行體外連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中,涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24h.挑取單克隆進行菌落PCR檢測,篩選陽性重組子,提取質(zhì)粒送深圳楉柚基因科技有限公司測序.

不同菌株16s rRNA基因的測序序列在GenBank的數(shù)據(jù)庫中進行BLAST分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov),獲取相似的同源參考序列,然后所有的序列利用Clustal W 1.6進行全序列比對,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹采用MEGA 5.1軟件的Neighbor-Joining算法[9],進化距離使用Kimura 2-parameter模型進行計算,系統(tǒng)發(fā)育樹使用1000次重復(fù)的Bootstraps進行統(tǒng)計學(xué)檢驗.

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離與鑒定

從紅樹林根際土壤中分離純化得到的菌株進行革蘭氏染色,確定其為革蘭氏陽性菌后,取其中形態(tài)特征較為明顯的19株菌株進行一系列的生化鑒定實驗分析,參照《伯杰式細菌鑒定手冊》,篩選接觸酶、V-P反應(yīng)、明膠水解和硝酸鹽利用為陽性的菌株[6-7],初步確定了10株疑似枯草芽孢桿菌,分別為JCHL-0207、JCHL-0209、CY-1、LMJ-17、YJQ-30、YJQ-69、YJQ-52、YJQ-40、YJQ-53、MR-0302和WI-252,其結(jié)果見表1.

表1 菌株的生化鑒定結(jié)果

(“+”表示該指標(biāo)呈陽性；“—”表示呈陰性。)

將19株芽孢桿菌(包含10株疑似枯草芽孢桿菌的菌株)分別點種于淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶篩選培養(yǎng)基上,培養(yǎng)48h后,測量不同篩選平板上單菌落的直徑(CD)和水解圈或透明圈的直徑(HD),通過比較HD/CD的比值來判斷不同菌株產(chǎn)酶能力的大小.從表2可以看出,能夠同時表現(xiàn)出淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的菌株共有10株,即JCHL-0207、JCHL-0209、CY-1、LMJ-17、YJQ-41、YJQ-30、YJQ-69、YJQ-2、YJQ-40和WI-252,這包含8株初步判定的疑似枯草芽孢桿菌(JCHL-0207、JCHL-0209、CY-1、LMJ-17、YJQ-30、YJQ-69、YJQ-40和WI-252).菌株YJQ-45的三種酶活性均未被檢測到,這明顯不符合枯草芽孢桿菌具有豐富酶系的特性.此外,與其他產(chǎn)三種酶的菌株的產(chǎn)酶能力相比,JCHL-0207、JCHL-0209和LMJ-17這三株菌具有較為明顯的高產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的綜合能力,尤其是JCHL-0207菌株,其綜合產(chǎn)酶能力最為突出.

表2 芽孢桿菌產(chǎn)酶能力測定結(jié)果

(“∕”代表未檢測到或不明顯；“*”表示顯著性，α=0.05)

2.3 細菌16s rRNA基因序列的系統(tǒng)進化分析

根據(jù)上述生化特征分析及產(chǎn)酶能力分析結(jié)果(見表1和表2),選取10株菌株,即JCHL-0207、JCHL-0209、CY-1、LMJ-17、YJQ-30、YJQ-69、YJQ-52、YJQ-40、YJQ-53、和WI-252,進行16s rRNA基因同源比對及系統(tǒng)發(fā)育分析,其Genbank分配號分別為KP834902、KP834901、KP834904、KP996671、KP834899、KP834895、KP834897、KP834898、KP834896和KP834900.以多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)為外群構(gòu)建16s rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖1所示),10個待鑒定菌株形成了2個主要大分支,其中LMJ-17、YJQ-30、JCHL0209、YJQ-53、YJQ-40和JCHL0207位于枯草芽孢桿菌大分支中,而YJQ-69、CY-1和WI-252位于臘樣芽孢桿菌大分支中.

在枯草芽孢桿菌大分支中,JCHL0209與枯草芽孢桿菌KJ957013的相似性達到99.5%,YJQ-40和JCHL0207形成一個小分支,位于枯草芽孢桿菌大分支中,其相似性達到99.5%.值得一提的是,YJQ-52與特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)KC851837一起形成一個小分支,并位于枯草芽孢桿菌大分支中,其相似性達到99.7%,造成這種結(jié)果的原因是特基拉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌16s rRNA基因序列極為相似(達到99%以上),兩者的生化特征也較為相似,在區(qū)分這兩種菌株時如果僅僅使用16s rRNA基因序列比對,則很容易將兩種菌構(gòu)建到一個分支中,需要結(jié)合其他手段才能將兩者進行區(qū)分[10].

在蠟樣芽孢桿菌大分支中,YJQ-69與蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)KF853117的相似性為99.9%,WI-252與蠟樣芽孢桿菌FJ210679的相似性為99.5%,CY-1與菌株KJ722447的相似性達到99.7%,而與WI-252的相似性為99.0%.

圖1 芽孢桿菌的16s rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

(分支支持強度(Bootstrap values)<50的未顯示. 括號內(nèi)為菌株序列號，分支上的數(shù)字為自展支持率，標(biāo)尺為進化距離。)

以上結(jié)果表明,YJQ-30、YJQ-53、YJQ-40、JCHL-0209、JCHL-0207和LMJ-17這六株菌確定為枯草芽孢桿菌,CY-1、YJQ-69和WI-252確定為臘樣芽孢桿菌,YJQ-52雖然位于枯草芽孢桿菌分支中,但其16s rRNA基因序列與已公布的特基拉芽孢桿菌KC851837極為相似,這需要通過進一步的實驗驗證.

3 結(jié)論

紅樹林是目前世界上少有的幾個物種多樣化的生態(tài)系統(tǒng)之一,因為其含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),對細菌的生長和繁殖來說是一個非常理想的環(huán)境,是細菌理想的棲息地[1-3].紅樹林因其獨特的生長環(huán)境孕育出了豐富并具有特色的微生物資源,細菌是其微生物生態(tài)系統(tǒng)中的主要類群,而芽孢桿菌為細菌的優(yōu)勢種,因而紅樹林中潛藏著豐富的芽孢桿菌類群[11-13].本研究從紅樹林根際土壤中分離及純化出19株芽孢桿菌,其中有10株具有產(chǎn)三種酶的能力,所占比例為52.6%,這說明在紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中存在較多的具有豐富酶系的芽孢桿菌菌株,其蘊含的微生物資源需值得重視.

目前,對細菌的分類學(xué)鑒定主要以傳統(tǒng)的細菌分類學(xué)方法為主,即以形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和生化等表型特征為依據(jù).隨著一些特殊微生物菌株的分離和發(fā)現(xiàn),偏向于主觀的傳統(tǒng)分類方法存在諸多的不足,而分子生物學(xué)最大的特點就是能對進化上相對保守的核苷酸序列進行分析,這從分子水平彌補和克服了傳統(tǒng)方法的主觀片面性,增加了對微生物菌株鑒定的準(zhǔn)確性[14-15].本研究通過對紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中植物根際土壤的芽孢桿菌進行分離和純化,參考常規(guī)生理生化特征對分離出來的菌株進行了初步判斷,獲取了10株疑似枯草芽孢桿菌,但系統(tǒng)發(fā)育分析表明,菌株CY-1、YJQ-69和WI-252與臘樣芽孢桿菌更為接近,而YJQ-52菌株與特基拉芽孢桿菌接近程度最高.造成這一現(xiàn)象的原因有兩點:一是臘樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌三個種的生化及形態(tài)特征較為相似,主觀判斷很難將其區(qū)分開來,這需要進一步使用分子手段進行16s rRNA基因分析才能最終確定其種屬;二是特基拉芽孢桿菌是一類特殊種,其與枯草芽孢桿菌的相似性高于99%,生化特征也極為相似,這需要結(jié)合進一步的分子實驗(如DNA雜交、功能基因比對、指紋圖譜等)加以區(qū)別和判斷.

枯草芽孢桿菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值,這主要歸功于其豐富的酶系和較高的環(huán)境抗逆性.因此,篩選和鑒定出高產(chǎn)酶枯草芽孢桿菌是其應(yīng)用于生產(chǎn)實踐的前提.本研究利用生理生化分析結(jié)合16s rRNA基因序列分析的方法準(zhǔn)確地從紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中篩選出5株產(chǎn)三種酶的枯草芽孢桿菌,其中JCHL-0207、JCHL-0209和LMJ-17三株菌的產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶能力的表現(xiàn)較為顯著,而JCHL-0207的產(chǎn)酶綜合能力最高,其可以在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用來高效轉(zhuǎn)化飼料中的淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素,這為今后將其應(yīng)用于生產(chǎn)實踐提供了重要的理論依據(jù).

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Isolation and Identification of Three Enzymes Producing Bacillus Subtilis from the Rhizosphere Soil of Mangrove Trees

MA Jun1,MA Rui1, YE Jia-qi1, LI Qi-lin1, JIANG Fang-yan1, QU Jiang-yong1,2

(1. College of Tropical Biology and Agronomy, Qiongzhou University, Sanya Hainan, 572022, China; 2. College of Life Sciences, Yantai University, Yantai Shandong， 264005, China)

The Bacillus strains which were separated and purificated from mangrove rhizosphere soil were measured by biochemical methods and enzyme producing ability analysis, and in eight strains were simultaneously detected the enzyme producing ability of amylase, cellulase and protease. In these multi-enzyme producing bacteria, three strains (JCHL-0209, JCHL-0207 and LMJ-17) had high enzyme production capacity, whereas especially the enzyme production capacity of the strain (JCHL-0207) was the most significant. According to the 16s rRNA gene sequence analysis, these strains (JCHL-0209, JCHL-0207 and LMJ-17) are both determined as Bacillus subtilis, which is used as the basis of productive practice.

Mangroves;bacillus subtilis;enzyme producing;16s rRNA

2015-06-08

瓊州學(xué)院校級青年科學(xué)基金(QYQN201323)；三亞院地合作項目(2013YD27,2014YD37)

馬軍(1982-),男,甘肅蘭州人，瓊州學(xué)院熱帶生物與農(nóng)學(xué)院講師,博士,研究方向為海洋微生物學(xué).

S668.4

A

1008-6722(2015) 05-0061-06

10.13307/j.issn.1008-6722．2015．05．14