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結(jié)核感染T細(xì)胞檢測在兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病中的診斷價值

2015-03-15 00:38:40賈晨光姚黎明李秀武劉豐勝章志華張金文
關(guān)鍵詞:抗酸骨關(guān)節(jié)結(jié)核

賈晨光,姚黎明*,李秀武,劉豐勝,章志華,張金文

(1.河北省胸科醫(yī)院骨科,河北 石家莊050041;2.河北省胸科醫(yī)院病理科,河北 石家莊050041;3.河北省胸科醫(yī)院科教處,河北 石家莊050041)

結(jié)核?。╰uberculosis,TB)的診斷及控制是全球公共衛(wèi)生面臨的難題。目前我國仍然是兒童結(jié)核感染發(fā)病率及病死率較高的發(fā)展中國家之一[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的資料,2006年全球結(jié)核病例新增800萬,兒童病例約130萬,其中10%~20%為肺外結(jié)核[2]。骨關(guān)節(jié)結(jié)核是結(jié)核病在肺外器官最常見的類型,約占結(jié)核病總?cè)藬?shù)的13%左右,好發(fā)于兒童和青少年。對結(jié)核分枝桿菌感染患者的快速診斷及成功治療是遏止結(jié)核病廣泛并快速傳播的核心步驟。在臨床工作中,準(zhǔn)確診斷兒童早期骨關(guān)節(jié)結(jié)核病尤為困難。目前國內(nèi)關(guān)于結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗(tuberculosis infection of T cells spot test,TSPOT.TB)應(yīng)用于兒童活動性結(jié)核診斷中的研究報道數(shù)量較少。本研究旨在評估T-SPOT.TB診斷兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年10月—2014年10月河北省胸科醫(yī)院骨科收治的診斷為骨關(guān)節(jié)結(jié)核的患兒36例,男性26例,女性10例,年齡7個月~14歲,平均(7.40±4.27)歲。參考中華醫(yī)學(xué)會《臨床診療指南》結(jié)核病分冊相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)病史、臨床特點、影像學(xué)表現(xiàn)、組織病理學(xué)、病原學(xué)檢查結(jié)果以及抗結(jié)核治療效果進(jìn)行診斷。見表1。

表1 36例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患兒臨床資料統(tǒng)計Table 1 Clinical characteristics of 36children patients confirmed with osteoarticular tuberculosis(n=36,例數(shù),%)

1.2 方法 所有患兒分別進(jìn)行涂片抗酸染色、結(jié)核菌培養(yǎng)、實時熒光定量PCR檢測、結(jié)核菌素PPD試驗、T-SPOT.TB,比較其陽性檢出率。根據(jù)病變部位(脊柱/四肢關(guān)節(jié))及年齡段(年齡≤3歲,>3~6歲,>6~9歲,>9~14歲)分別比較T-SPOT.TB陽性檢出率。

1.2.1 涂片抗酸染色 所有診斷為骨關(guān)節(jié)結(jié)核病患者的標(biāo)本處理均依據(jù)“中國防癆協(xié)會指導(dǎo)方針”[3]進(jìn)行。將采集的關(guān)節(jié)腔積液、病灶膿液標(biāo)本,經(jīng)離心沉淀集菌后,用少量生理鹽水混勻沉淀物,均勻涂抹于載玻片上,自然干燥后,行抗酸染色鏡檢。

1.2.2 結(jié)核菌培養(yǎng) 將采集的關(guān)節(jié)腔積液、病灶膿液標(biāo)本經(jīng)消化處理后,接種于羅氏培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng),接種后3d、7d觀察,此后每周觀察1次,有菌落生長后用抗酸染色驗證,若同時為陽性記錄為陽性,否則為陰性,至第8周仍無細(xì)菌生長記錄為陰性。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測 活檢或手術(shù)標(biāo)本采用熒光定量試劑盒檢測結(jié)核分枝桿菌DNA,具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。標(biāo)本經(jīng)去污和離心后,得到50μL DNA提取液,混勻后沸水煮10min,4℃放置6~8h。離心10 000r/min 5min,取上清用于實時熒光定量PCR檢測。

1.2.4 結(jié)核菌素PPD試驗 注射0.1mL(5U)于患兒的前臂掌側(cè)皮內(nèi),72h觀察注射部位的反應(yīng)情況。評價標(biāo)準(zhǔn)參照“中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施工作指南(2008版)”標(biāo)準(zhǔn)[4]:硬結(jié)直徑(d)<5mm 為陰性(-);5~10mm 為弱陽性(+);>10~20mm為陽性(++);>20mm或局部出現(xiàn)水泡、壞死或有淋巴炎為強陽性(+++)。

1.2.5 T-SPOT.TB 受試者用肝素鋰抗凝采血管抽取5mL靜脈血,即刻輕柔顛倒混勻3~5次,使抗凝劑充分溶解。3h內(nèi)將采集的全血分裝到3種不同的培養(yǎng)管中,“T”為添加了結(jié)核特異性抗原早期分泌抗原靶蛋白6、培養(yǎng)濾液蛋白10的測試培養(yǎng)管,“N”為本底對照培養(yǎng)管,“P”為添加了非特異刺激原植物血凝素的陽性對照培養(yǎng)管,每種培養(yǎng)管分裝1mL,分裝前需要顛倒混勻3次以上,分裝后輕柔顛倒培養(yǎng)管5次并立刻置于37℃培養(yǎng)箱中,靜置培養(yǎng)(22±2)h后取出,離心收集上清液,然后用雙抗體夾心法定量檢測上清中γ干擾素的含量,最后計算刺激培養(yǎng)系統(tǒng)中特異性升高的γ干擾素的量來判定是否為結(jié)核桿菌感染陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SSPS 14.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計數(shù)資料以百分率表示,采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各種檢測方法陽性檢出率比較 T-SPOT.TB陽性檢出率(75.00%,27/36)顯著高于涂片抗酸染色陽性檢出率(8.33%,3/36)、結(jié)核菌培養(yǎng)陽性檢出率(50.00%,18/36),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或<0.01);略高于實時熒光定量PCR檢測陽性檢出率(61.11%,22/36)及結(jié)核菌素PPD試驗陽性檢出率(66.67%,24/36),但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 T-SPOT.TB與其他臨床常用檢測方法陽性檢出率比較Table 2 The positive rate of T-SPOT.TB in comparison with other commonly used clinical methods (例數(shù))

2.2 不同病變部位及年齡段T-SPOT.TB陽性檢出率比較 36例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患兒中包括22例脊柱結(jié)核和14例關(guān)節(jié)結(jié)核患兒,T-SPOT.TB診斷脊柱結(jié)核的陽性檢出率高于四肢關(guān)節(jié)結(jié)核,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。36例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患兒中年齡≤3歲10例,>3~6歲4例,>6~9歲6例,>9~14歲13例,4個年齡段T-SPOT.TB陽性檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同病變部位和年齡段T-SPOT.TB陽性檢出率比較Table 3 The positive rate of T-SPOT.TB for different locations and age stages of osteoarticular tuberculosis(例數(shù),%)

3 討 論

目前結(jié)核病在全球已呈現(xiàn)明顯回升趨勢,兒童病例數(shù)亦有顯著增加。在臨床實際工作中時常會遇到令醫(yī)師尷尬的現(xiàn)象,即依臨床體征、影像學(xué)表現(xiàn)高度懷疑骨關(guān)節(jié)結(jié)核病變,并有紅細(xì)胞沉降率增快、C反應(yīng)蛋白增高,但結(jié)核菌素試驗、結(jié)核抗體和穿刺液涂片、TB-DNA、結(jié)核菌培養(yǎng)等結(jié)核方面的特異性檢驗結(jié)果均為陰性,甚至手術(shù)后病理結(jié)果僅提示慢性感染。由于抗結(jié)核藥物治療是一個漫長的過程,一旦在誤診的條件下實施藥物治療,不僅會增加藥物不良反應(yīng)的危險,骨關(guān)節(jié)破壞性病變也勢必加重,甚至產(chǎn)生不可修復(fù)的損害。在缺乏診斷結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)或病理學(xué)證據(jù)的前提下能否給予接受試驗性抗結(jié)核藥物治療是擺在醫(yī)師與患兒家長面前無法回避的共同難題。查閱文獻(xiàn)資料并結(jié)合我們的臨床工作體會,造成早期兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病診斷困難的原因可歸納為:①我國兒童普遍預(yù)防接種了卡介苗,機(jī)體對結(jié)核感染有一定抵抗能力,故早期兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核的臨床和影像學(xué)表現(xiàn)都不很典型;②患兒多為學(xué)齡前期兒童,故難于獲得準(zhǔn)確主訴甚至無主訴,增加了診斷上的困難;③兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶內(nèi)載菌量較低,故相應(yīng)組織學(xué)及病原學(xué)獲得陽性結(jié)果較為困難[5]。

回顧以往傳統(tǒng)檢測方法各有不足:抗酸染色檢測法的陽性率非常低,在本次研究中為8.33%(3/36);被認(rèn)為是結(jié)核病臨床診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”的結(jié)核菌培養(yǎng),因耗時長(6~8周)、陽性率低,而使其應(yīng)用受到限制;且以上檢測均為侵襲有創(chuàng)性操作,意味著患兒需承擔(dān)相應(yīng)痛苦及風(fēng)險[6-7]??梢娨陨戏椒▽τ诤Y選兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病并不是最理想的選擇。

由于原有的結(jié)核診斷方法存在自身無法克服的缺陷,T-SPOT.TB給現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)帶來快速、特異、靈敏準(zhǔn)確的結(jié)核感染診斷方法。目前,歐洲、加拿大、美國均已審批應(yīng)用,成為替代診斷結(jié)核感染的最主要方法[8]。該方法的基本原理是:當(dāng)體內(nèi)曾經(jīng)受到結(jié)核分枝桿菌抗原刺激而致敏的T淋巴細(xì)胞再次遇到同類抗原時能產(chǎn)生γ干擾素。通過進(jìn)行T-SPOT.TB,從單細(xì)胞水平檢測分泌γ干擾素的細(xì)胞數(shù)目,準(zhǔn)確判斷機(jī)體是否存在結(jié)核感染,輔助診斷結(jié)核病。

本研究TB-SPOT.TB陽性檢出率為75.00%,與我們之前系列研究中報告的82.5%接近[9],且在不同年齡段、不同病變部位(脊柱/四肢關(guān)節(jié))間陽性檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義,體現(xiàn)出對診斷各年齡段及不同病變部位的兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病均有良好的一致性。與上述傳統(tǒng)檢查相比,TB-SPOT.TB優(yōu)勢體現(xiàn)在:①敏感度高,TB-SPOT.TB明顯優(yōu)于抗酸染色、結(jié)核菌培養(yǎng);②快速安全簡便,簡單的血液檢測,隔天即報告結(jié)果,可避免對患兒造成創(chuàng)傷,特別是在病灶取活檢困難或外科手術(shù)指征不充分時;③特異性好,TB-SPOT.TB利用了結(jié)核分枝桿菌所特有的抗原靶6和培養(yǎng)濾液蛋白作為抗原刺激誘發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng),只針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感,對大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗無交叉反應(yīng),而PPD是多種蛋白成分的混合物,其容易受到接種卡介苗和環(huán)境分枝桿菌感染的影響,診斷結(jié)核分枝桿菌感染和結(jié)核病特異性相對較低[10]。

綜上所述,T-SPOT.TB作為一種新的診斷技術(shù),在兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的臨床診斷中具有較好的應(yīng)用價值,有助于探索并建立診斷兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的新方案。

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