王璐瑤，范海江，李建洪，王永模

（華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術學院，武漢，430070）

一般來說，單個精子產(chǎn)生所需要的能量遠遠低于單個卵子產(chǎn)生所需要的能量，然而越來越多的研究表明，大量精子產(chǎn)生的代價也是高昂的[1～3]。在聚集生活條件下，雄性面臨著激烈的競爭，包括交配前的求偶競爭以及交配后的精子競爭[4]。對于有多次交配習性的種類，精子競爭主要指不同來源的精子在雌性體內(nèi)對受精機會的爭奪，而受精機會是有限的，這會使競爭失利的雄蟲付出較高代價[5]。

雄性會根據(jù)競爭者數(shù)量來對未來精子競爭的激烈程度做出預測，并相應改變交配行為和生殖生理的現(xiàn)象稱作雄性競爭可塑性[6]。例如雄性會改變精子數(shù)量或者生殖附腺分泌物的量[7，8]；在一種果蠅（Drosophila melanogaster）中，當出現(xiàn)多個雄蟲時，雄蟲會增大對射精物質的投資并獲得較高的生殖成功率[9]；Garbaczewska 等[10]報道了這種果蠅雄性個體在預判到競爭時，會提高射精物質中的精子數(shù)量。雄性在交配時輸送給雌性的生殖附腺分泌物能夠延長雌性再次交配的時間，并且加快雌性的產(chǎn)卵速率[11～14]，這大大增加了雄性精子與卵子結合的幾率。雄性果蠅在遇到其他競爭者時會加大附腺蛋白的量來延長雌蟲再次交配的時間間隔[8]；在面臨競爭時，雄蟲也會主動改變交配時長，通常情況下，有其他雄性在旁邊時，雄性的交配時長會延長，然而無其他雄蟲存在時交配時長會縮短，這在幾種果蠅當中都有報道[8，9，15]。其他生物種類中也存在交配延長的現(xiàn)象，如家鼠遭遇精子競爭時，雄性的交配時長會明顯延長[16]。但是一些種類中卻有相反的報道，如另一種果蠅（Drosophila bifasciata），當其暴露給其他雄性時，雄性的交配時長沒有被延長[6]。大多數(shù)雄蟲生殖競爭可塑性反應的研究起始于羽化到交配之前這一階段，然而，有研究發(fā)現(xiàn)粘蟲成蟲和幼蟲生活的密度會影響到其成蟲階段的精子配置[17，18]，這表明交配行為可塑性可能發(fā)生于更早的幼蟲時期，且可能會受到幼蟲生活密度的影響。

菱角螢葉甲Galerucella birmanicaJacoby 屬鞘翅目（Coleoptera），葉甲科（Chrysomelidae），主要分布于中國、印度等亞洲國家[19]。由于該蟲食性單一，幾乎只取食菱角，所以是菱角最重要的害蟲之一，被害株率能夠達到30%～65%，大暴發(fā)可為害整個植株的水上部，并顯著降低菱角的質量和產(chǎn)量[20，21]。野生菱角來自北美的一種為害嚴重的入侵雜草[22]，這使得菱角螢葉甲成為了其潛在的有效天敵。

目前為止，關于菱角螢葉甲的研究主要集中于基本生物學的描述和化學防治方法介紹[20，21，23，24]，對該蟲的交配行為研究比較少。研究該蟲的繁殖行為學對于預測菱角螢葉甲種群增長有著重要作用，同時可為今后雄性不育防治方法研發(fā)提供指導；另外作為生防作用物，了解其交配行為能給大規(guī)模飼養(yǎng)提供理論依據(jù)。本文在幼蟲期以及隨后的成蟲期設置了不同飼養(yǎng)密度，以交配時長、交配反應時間、精子數(shù)量和附腺分泌物量為指標，研究菱角螢葉甲雄蟲競爭是否存在可塑性，探索雄蟲競爭可塑性是形成于幼蟲階段還是成蟲階段。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2014 年4 月于湖北武漢市野芷湖（E 114°3＇，N 30°50＇），將采集到的完整卵塊放入到直徑為15 cm的塑料培養(yǎng)皿中，卵塊在（28±0.5）℃、光照條件L∶D=10∶14 和相對濕度（80±5）%的條件下孵化。待卵塊孵化后，將初孵幼蟲放入裝有新鮮菱角葉片的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放入20 頭幼蟲，培養(yǎng)皿中放入濕潤的海綿保濕。每隔2 d 換1 次葉片，用細毛筆輕輕將幼蟲挑到新鮮的葉片上，待其化蛹。當成蟲羽化后，將成蟲放入到上述環(huán)境條件下飼養(yǎng)，每個培養(yǎng)皿10 頭成蟲。連續(xù)飼養(yǎng)4 代，將第4 代成蟲的卵塊收集后放在同樣的條件下培養(yǎng)，孵化的幼蟲作為以下試驗的供試蟲源。

1.2 幼蟲和成蟲飼養(yǎng)密度設置

將初孵幼蟲按高低2 種密度接入直徑15 cm塑料培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿1 頭初孵幼蟲為低密度（用L 表示）；每個培養(yǎng)皿20 頭初孵幼蟲為高密度（用H 表示）。將不同密度下剛羽化后的成蟲在顯微鏡（Nikon,SMZ745T）下進行雌雄分離，得到未交配的雌雄蟲。將分離出的雄蟲又分為高低2 種密度飼養(yǎng)，每個培養(yǎng)皿1 頭成蟲為低密度（用S 表示），每個培養(yǎng)皿5 頭成蟲為高密度（用M 表示）。這樣就形成了4 個處理，即幼蟲低密度成蟲低密度（LS）、幼蟲低密度成蟲高密度（LM）、幼蟲高密度成蟲低密度（HS）、幼蟲高密度成蟲高密度（HM）。成蟲3 d左右達到性成熟，為了讓雄蟲有足夠時間感受到其他雄蟲的存在，將雄成蟲在培養(yǎng)皿中飼養(yǎng)5 d 后進行下一步試驗。

1.3 交配行為觀察及生殖腺分泌物測量

隨機選擇1 頭不同處理的雄蟲，放入裝有1 頭未交配雌蟲的培養(yǎng)皿中，雌蟲日齡與雄蟲相同，讓雄蟲與雌蟲發(fā)生交配。記錄雄蟲的交配反應時長（從放入到開始交配的時長）、交配持續(xù)時長、雌蟲交配后開始產(chǎn)卵時長。交配后飼養(yǎng)條件參見供試蟲源中的敘述。每個處理15 次重復。

另外在不同處理中取出未交配的5 日雄蟲，測量雄蟲精子數(shù)量和生殖附腺蛋白含量。精子數(shù)量的測定參考Katsuki 等[25]方法，將雄蟲殺死后在顯微鏡下解剖，將解剖出來的生殖組織放入到20 μL 的磷酸緩沖液中，取出精囊后放入裝有500 μL 生理緩沖液的離心管中，使用昆蟲針將精囊弄碎，之后加入10 μL 的DAPI 熒光染色溶液（0.05 g/mg），在遮光搖床上振蕩10 min。當充分染色后，取5 μL 樣品滴在蓋玻片上（滴成圓形，測量其面積），在200 倍熒光顯微鏡（OLYMPUS SZX16）下統(tǒng)計數(shù)量。利用血細胞基數(shù)板測出200 倍視野下的面積為0.96 mm2。在一個視野面積中觀察精子的數(shù)量，為了統(tǒng)計精確，隨機選取3 個視野進行數(shù)量統(tǒng)計，然后取平均值，10 次重復。精子數(shù)量=（200 倍視野面積精子個數(shù)×5 μL 樣品面積）/（200 倍視野下的面積×溶液總量），其中溶液總量為510 μL。

附腺蛋白含量的測定參見曲春香等[26]的方法，將雄蟲殺死后在顯微鏡下解剖，將解剖出來的生殖組織放入20 μL 的磷酸緩沖液中，取出生殖附腺后放入500 μL 的生理鹽水中（0.65%），用昆蟲針扎破后使蛋白充分流入到生理鹽水中，之后在酶標儀中（BIORAD XMarkTM）測定蛋白含量，10 次重復。蛋白含量測定采用南京建成蛋白定量測試盒 （貨號：A045-2）。

圖1 不同處理下的雄性交配反應時長（A），交配時長（B），精子數(shù)量（C），附腺蛋白含量（D）

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析。雄性交配反應時長、交配持續(xù)時長、精子數(shù)量以及附腺蛋白含量采用雙因素方差分析，處理組合的多重比較采用LSD 法，雌蟲交配后到產(chǎn)卵時長數(shù)據(jù)處理 采 用 單 因 素 方 差 分 析 。

2 結果與分析

2.1 交配反應時長

交配反應時長受到成蟲階段飼養(yǎng)密度的影響，幼蟲階段飼養(yǎng)密度對交配時長沒有顯著影響，幼蟲密度和成蟲密度對交配反應時長的影響沒有交互作用。LS 處理下的交配反應時長（11.89±2.21）min，LM處理下的交配反應時長（39.50±7.39）min，兩者之間存在極顯著差異；HS 處理下的交配反應時長（15.93±2.82）min，HM 處 理 下 的 交 配 反 應 時 長（38.87±8.54）min，兩者之間也存在極顯著差異（圖1A）。

2.2 交配持續(xù)時長

交配持續(xù)時長未受到成蟲階段密度的影響，幼蟲階段密度對交配持續(xù)時長也沒有顯著影響，幼蟲密度和成蟲密度兩因素之間沒有交互作用。LS 處理的交配時長（51.32±4.95）min，LM 處理的交配時長（39.50±5.94）min，它們之間沒有顯著性差異，HS處理的交配時長（15.93±2.82）min，HM 處理的交配時長（38.87±8.54）min，兩者不存在顯著差異（圖1B）。

2.3 精子數(shù)量

精子數(shù)量未受到雄成蟲密度的影響，LS 處理的精子數(shù)量為 （7.03±1.95）×104，LM 處理的精子數(shù)量（8.31±1.38）×104，兩者之間沒有顯著性差異；HS處理的精子數(shù)量（10.80±1.80）×104，HM 處理的精子數(shù)量（8.07±1.63）×104，也不存在極顯著差異。幼蟲密度對精子數(shù)量無顯著影響，幼蟲密度及雄成蟲密度兩因素對精子數(shù)量的影響沒有交互作用（圖1C）。

2.4 附腺蛋白含量

表1 雌蟲與不同處理雄蟲交配后產(chǎn)卵前期的變化

附腺蛋白含量受到幼蟲密度的影響，LS 處理的附腺蛋白濃度（0.83±0.09）mg/μL，LM 處理的附腺蛋白濃度（0.75±0.10）mg/μL，兩者存在極顯著差異，HS 處理的附腺蛋白濃度（0.80±0.09）mg/μL，HM 的附腺蛋白濃度（1.20±0.08）mg/μL，兩者之間不存在極顯著差異。而雄成蟲密度對附腺蛋白的含量沒有顯著影響，幼蟲密度及雄成蟲密度兩因素對附腺蛋白含量的影響存在交互作用（圖1D）。

2.5 雌蟲交配之后到產(chǎn)卵的時長

雌蟲與不同處理的雄蟲交配后，從交配到產(chǎn)卵的時長存在顯著差異。LS、LM、HS 處理之間差異不顯著，但都與HM 處理存在顯著差異。HM 處理的交配后到產(chǎn)卵時長比HS 的縮短了24.17 h（表1）。

3 討論與結論

本試驗結果表明，菱角螢葉甲雄蟲在面臨競爭時會改變自己的競爭對策，包括交配反應時長的延長以及附腺物質含量的增多，這表明雄蟲處在競爭條件下的交配行為和生理反應是可塑的。幼蟲的生活密度引起了附腺蛋白含量的改變，說明雄蟲交配行為的可塑性可能起始于幼蟲階段；幼蟲生活密度以及成蟲密度都增加了附腺蛋白的分泌，表明二者在雄性的競爭可塑性中同時起作用。

雄性會根據(jù)視覺、觸覺或者聽覺來感知競爭者的存在及數(shù)量[7，15]，并通過之前的生活經(jīng)歷來改變其交配行為。當遭遇到多個競爭者時，雄蟲表現(xiàn)出對雌蟲不敏感，具體表現(xiàn)為對雌蟲的求偶變得遲緩（圖1A）。當感受到多個雄蟲存在時，雄蟲會認為當前的精子競爭壓力比較大，為了避免浪費能量進而使自身的生殖利益最大化，雄蟲選擇雌蟲交配時會比較謹慎。之前的很多研究表明，雄性在遭遇到精子競爭時會改變交配時長，在幾種果蠅當中都有這種行為的發(fā)生[8，9，15]；而我們的研究發(fā)現(xiàn)，雄蟲在面臨競爭時，交配時長未表現(xiàn)出明顯的差異（圖1B）。一方面，前人研究表明雄蟲在遇到競爭時會改變其交配行為和生理，例如求偶行為的改變[7]，精子數(shù)量和質量的改變[2]，以及附腺蛋白含量的改變[8]等，交配時長的改變只是其交配行為和生理改變的一部分，因此這種改變不一定會表現(xiàn)為交配時長的變化。另一方面， 之前的研究表明在一種果蠅（Drosophila melanogaster）中，雄蟲的交配時長與暴露給其他競爭者的時長正相關，而與競爭者的數(shù)量沒有關系[27]，在我們的試驗中沒有考慮到暴露時長這一因素，在菱角螢葉甲中暴露時長與交配時長的關系還有待進一步研究。另外，Bretman[28]認為對交配時長的控制是雌雄共有性狀，性狀的變化由雌雄蟲共同控制，并不是由雄蟲單方面控制，而本文雄蟲在交配時長中沒有差異，很可能是雌雄蟲雙方共同控制的。

在感受到激烈競爭的情況下，雄蟲在交配中會提高附腺蛋白含量，本文的研究結果與前人相似，但之前的研究階段是在羽化到交配這一時段，而本研究表明幼蟲生活密度對附腺蛋白含量的改變起到了關鍵作用（圖1D），這是一個新的發(fā)現(xiàn)。雖然成蟲競爭者數(shù)量沒有對附腺蛋白含量起到影響，但是幼蟲密度/成蟲競爭者數(shù)量與附腺蛋白含量的提高間具有交互作用，至于二者之間的交互作用機理還不清楚。雌蟲交配到產(chǎn)卵的時間存在顯著差異（表1），分析是附腺蛋白含量不同所致，因為之前的研究表明，雄性在交配時輸送給雌性的生殖附腺分泌物能夠延長雌性再次交配的時間，并且可加快雌蟲產(chǎn)卵。本研究還發(fā)現(xiàn)，精子數(shù)量沒有受到幼蟲生活密度以及成蟲競爭者數(shù)量的影響（圖1C），這表明在競爭中，雄性沒有通過改變精子數(shù)量來獲取競爭力。

[1]Dewsbury D A.Ejaculate cost and male choice[M].American Naturalist,1982:601-610.

[2]Wedell N,Gage M G,Parker G A.Sperm competition,male prudence and sperm limited females[J].Trends in Ecology and Evolution,2002,17(7):313-320.

[3]Tang-Martinez Z,Ryder T B.The problem with paradigms:Bateman's worldview as a case study [J].Integrative and Comparative Biology,2005,45(5):82-830.

[4]Parker G A,Pizzari T.Sperm competition and ejaculate economics[J].Biological Reviews,2010,85(4):897-934.

[5]Simmons L W.Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects [M].Princeton University Press,2001.

[6]Lizé A,Price T,Marcello M,Smaller E A,et al,Hurst GDD.Males do not prolong copulation in response to competitor males in the polyandrous fly Drosophila bifasciata[J].Physiological Entomology,2012,37(3):227-232.

[7]Bretman A,Gage M J G,Chapman T.Quick-change artists:adult behavioural plasticity at mating[J].Trends in Ecology and Evolution,2011,26:467-473.

[8]Wigby S,Sirot L K,Linklater J R,et al.Seminal fluid protein allocation and male reproductive success[J].Current Biology,2009,19(9):751-757.

[9]Bretman A,Fricke C,Chapman T.Plastic responses of maleDrosophila melanogasterto the level of sperm competition increase male reproductive fitness [J].Proceedings of the Royal Society: Biological Sciences, 2009, 276(1 662):1 705-1 711.

[10]Garbaczewska M,Billeter J C,Levine J D.Drosophila melanogastermales increase the number of sperm in their ejaculate when perceiving rival males[J].Journal of Insect Physiology,2013,59(3):306-310.

[11]Eberhard WG.Female control:sexual selection by cryptic female choice[J].Princeton University Press,1996.

[12]Wolfner M F.Tokens of love:functions and regulation ofDrosophilamale accessory gland products[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,1997,27(3):179-192.

[13]Cameron E,Day T,Rowe L.Sperm competition and the evolution of ejaculate composition[J].The American Naturalist,2007,169(6):158-172.

[14]Avila F W,Sirot L K,Laflamme B A,et al.Insect seminal fluid proteins:identification and function[J].Annual Review of Entomology,2011,56:21-40.

[15]Kim,W J,Jan L Y,Jan Y N.Contribution of visual and circadian neural circuits to memory for prolonged mating induced by rivals [J].Nature Neuroscience,2012,15(6):876-883.

[16]Klemme I,Firman R C.Male house mice that have evolved with sperm competition have increased mating duration and paternity success[J].Animal Behaviour,2013,85(4):751-758.

[17]Cook P A,Gage M.Effects of risks of sperm competition on the numbers of eupyrene and apyrene sperm ejaculatedby the mothPlodia interpunctella(Lepidoptera:Pyralidae)[J].Behavioral Ecology and Sociobiology,1995,36(4):261-268.

[18]He Y,Miyata T.Variations in sperm number in relation to larval crowding and spermatophore size in the armyworm,Pseudaletia separata[J].Ecological Entomology,1997,22(1):41-46.

[19]Pemberton R W.Natural enemies ofTrapaspp in northeast Asia and Europe[J].Biological Control,1999,14(3):168-180.

[20]陸自強，朱建，祝樹德，等.菱角莼菜害蟲——菱角螢葉甲的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學，1984（5）：73-76.

[21]司升云，吳仁鋒.菱角螢葉甲的識別與防治[J].長江蔬菜，2008（4）：26.

[22]Patidar D C,Thakur G S,Yadav J S,et al.Feeding capacity ofSinghara beetle,Galerucella birmanicaJacoby[J].Journal of Insect Science,1994,7(1):102-103.

[23]鄭福山，杜予州，盧艷陽，等.菱角螢葉甲種群空間格局研究[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報，2006（4）：171-175.

[24]Ding J,Blossey B,Du Y,Zheng F.Galerucella birmanica(Coleoptera:Chrysomelidae)a promising potential biological control agent of water chestnutTrapa natans[J].Biological Control,2006,36(1):80-90.

[25]Katsuki M,Miyatake T.Effects of temperature on mating duration,sperm transfer and remating frequency in Callosobruchus chinensis [J].Journal of Insect Physiology,2009,55(2):113-116.

[26]曲春香，沈頌東，王雪峰，等.用考馬斯亮藍測定植物粗提液中可溶性蛋白質含量方法的研究[J]. 蘇州大學學報：自然科學版，2006（4）：83-85.

[27]Bretman A,Westmancoat J D,Gage M J,et al.Individual plastic responses by males to rivals reveal mismatches between behaviour and fitness outcomes[J].Proceedings of the Royal Society B:Biological Sciences,2012,279(1 739):2 868-2 876.

[28]Bretman A,Westmancoat J D,Chapman T.Male control of mating duration following exposure to rivals in fruitflies[J].Journal of Insect Physiology,2013,59(8):824-827.