王春雷， 高季平， 趙憲坤

(揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

梨是典型的自交不親和性果樹(shù)，生產(chǎn)上通常需要配置花期一致、S基因型不同的品種作為授粉樹(shù)。目前，常見(jiàn)梨樹(shù)品種的S基因型大多被鑒定。但在生產(chǎn)和育種工作中梨樹(shù)品種S基因型鑒定仍然必不可少。比如，育種獲得的梨樹(shù)新品種及新發(fā)現(xiàn)的地方品種，這些品種的S基因型就需要鑒定。

薔薇科李屬果樹(shù)S基因型可以通過(guò)SFB序列或者S-RNase序列確定。但與李屬植物不同，梨屬花粉S基因至今還沒(méi)有確定。因此，梨屬植物的S基因型只能根據(jù)S-RNase序列判斷。梨屬S基因具有5個(gè)保守區(qū)域，分別是C1區(qū)、C2區(qū)、C3區(qū)、C5區(qū)以及薔薇科植物特有的RC4區(qū)，此外還有一個(gè)高變區(qū):RHV區(qū)。根據(jù)S-RNase基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出大量以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的果樹(shù)S基因型鑒定法，最常用的是PCR電泳法。但是此方法有一些弊端，例如該方法很難區(qū)分長(zhǎng)度相似的S等位基因［1-2］，利用半自動(dòng)測(cè)序儀雖然能精確確定PCR產(chǎn)物大小，但是這種半自動(dòng)測(cè)序儀價(jià)格昂貴，不適合推廣［1-3］，圓點(diǎn)雜交也是利用探針檢測(cè)PCR產(chǎn)物，但是圓點(diǎn)雜交操作難度大，測(cè)試周期長(zhǎng)［4］。

PCR-酶聯(lián)免疫分析技術(shù)開(kāi)發(fā)于上世紀(jì)80年代，主要用于診斷植物病害和人類疾病［5-7］，也可以用來(lái)檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性 。在該方法中，PCR產(chǎn)物的序列通過(guò)探針雜交來(lái)檢測(cè)，并通過(guò)免疫反應(yīng)來(lái)檢測(cè)探針是否與PCR產(chǎn)物結(jié)合。本研究擬建立一種基于PCR-酶聯(lián)免疫反應(yīng)鑒定梨樹(shù)S基因型的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用8個(gè)日本砂梨品種采自揚(yáng)州大學(xué)園藝場(chǎng)，品種名和其S基因型分別為愛(ài)宕(S2S5)，愛(ài)甘水(S4S5)，二十世紀(jì)(S2S4)，豐水(S3S5)，今村秋(S1S6)，秋榮(S4smS5)，新高(S3S9)和幸水(S4S5)。這些品種包含7個(gè)等位基因和1個(gè)等位基因的突變體。采集各品種花前1～2 d的花蕾收集花柱，每20朵花的花柱存于1個(gè)1.5 ml離心管中，貯于－70℃冰箱中備用。

表1 探針和引物序列Table 1 The sequences of probes and primers

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA制備 從－70℃冰箱中取出花柱，花柱總RNA提取使用SV 96 total RNA isolation system試劑盒(Promega，USA);cDNA合成使用iScriptTMcDNA合成試劑盒(BioRad，USA)，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物和探針制備 本試驗(yàn)所需引物和單鏈核苷酸探針序列如表1所示，該對(duì)引物正向引物經(jīng)生物素(Biotin)標(biāo)記，引物擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物大小在450 bp左右，該產(chǎn)物包含S-RNas e等位基因的高變區(qū)(RHV)。各S基因等位基因單鏈核苷酸探針主要是根據(jù)各S等位基因RHV區(qū)域序列設(shè)計(jì)獲得，各探針Tm值均為60℃。用于檢測(cè)PCR產(chǎn)物的探針，除了包含S等位基因探針序列，還包括一個(gè)6 bp的TATATT間隔序列和一個(gè)23 bp的檢測(cè)序列(5'-TACATTCGCAATTGAGGCTTCGT-3')，該檢測(cè)序列與地高辛(Digoxin)標(biāo)記的檢測(cè)探針序列互補(bǔ)。雜交的原理如圖1所示。

1.2.3 序列雜交 各品種S等位基因DNA片段通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得。PCR反應(yīng)體系為:50μl反應(yīng)體系中加入20 ng cDNA，20 pmol正反向引物，1×Ex Taq緩沖液，400 μmol/L dNTPs，2.5 U Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa Biomedicals，Japan)。PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃ 變性30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸 1 min。反應(yīng)結(jié)束后，每5μl PCR產(chǎn)物添加100μl PBST緩沖液和50μg鏈酶親和素包裹的磁力球(Roche，Germany)，94℃孵育30 min。隨后，加入50μl變性溶液(0.5 mol/L NaOH，10 mmol/L EDTA)，使磁力球結(jié)合的PCR產(chǎn)物變成單鏈，PBST緩沖液沖洗2遍。再加入200μl雜交緩沖液(5×SCC 緩沖液，0.3%Tween-20，50 pmol S等位基因探針和地高辛標(biāo)記的檢測(cè)探針)，50℃雜交2 h。PBST緩沖液清洗2遍，與含1%抗地高辛堿性磷酸酶(Anti-digoxigenin IgG Fab fragment conjugated with alkaline phosphatase，Roche，Germany)的 PBST緩沖液室溫孵育30 min。PBST清洗2次后，再與PNPP(Thermo，USA)在37℃反應(yīng)，根據(jù)顏色變化判斷雜交結(jié)果，如果呈黃綠色，表示該S等位基因探針與PCR產(chǎn)物互補(bǔ)，即該品種包含1個(gè)該S基因型。

圖1 PCR-ELSIA梨樹(shù)S基因型鑒定法流程示意圖Fig.1 Schemes of S genotyping in pear by PCR-ELSIA method

2 結(jié)果

在本試驗(yàn)中，我們一共設(shè)計(jì)了7個(gè)單鏈核苷酸探針，各探針?lè)謩e與Pyrus pyrifolia S-RNase中的S1、S2、S3、S4、S5、S6和 S7等位基因特異互補(bǔ)。探針序號(hào)與其對(duì)應(yīng)的等位基因序號(hào)相同。完成所有試驗(yàn)步驟后，如果該溶液呈黃綠色，表明PCR產(chǎn)物與該S等位基因特異結(jié)合，即測(cè)試品種擁有此S等位基因。

試驗(yàn)中，一共測(cè)試了8個(gè)品種，除品種秋榮外，每一個(gè)品種花柱RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物都能與2個(gè)探針互補(bǔ)雜交結(jié)合(圖2)。其中愛(ài)宕能與探針2和探針5結(jié)合，愛(ài)甘水能與探針4和探針5結(jié)合，二十世紀(jì)能與探針2和探針4結(jié)合，豐水能與探針3和探針5結(jié)合，今村秋能與探針1和探針6結(jié)合，新高能與探針3和探針9結(jié)合，幸水能與探針4和探針5結(jié)合。雜交結(jié)果符合各品種S基因型。因?yàn)镾4sm在秋榮花柱中不表達(dá)，所以秋榮PCR產(chǎn)物只與探針5呈陽(yáng)性反應(yīng)。其他無(wú)探針結(jié)合雜交，溶液則無(wú)明顯顏色反應(yīng)。

圖2 PCR-ELSIA梨S基因型鑒定探針雜交后PNPP顏色反應(yīng)結(jié)果Fig.2 The coloring reaction with PNPP of Sgenotype by PCRELISA after probe hybridation

3 討論

S基因型鑒定是果樹(shù)栽培中一項(xiàng)重要任務(wù)，它為果園授粉樹(shù)的配置提供依據(jù)。S基因型鑒定最早是通過(guò)觀察授粉后坐果率或者花粉管生長(zhǎng)情況獲得，隨后該方法被更加快速、可靠的PCR擴(kuò)增法取代。目前，最常用的方法就是通過(guò)通用引物擴(kuò)增，電泳鑒定PCR產(chǎn)物大小的方法判斷S基因型。這種方法缺陷是不能區(qū)分大小相近的S等位基因［9-11］。為了解決這個(gè)問(wèn)題，有學(xué)者提出使用半自動(dòng)測(cè)序儀精確測(cè)定 PCR 產(chǎn)物大小［1-3，12］，該方法可以精確分辨產(chǎn)物1 bp大小差別，但是該方法需要使用昂貴的儀器。本研究利用等位基因特異探針鑒定PCR產(chǎn)物，不需要昂貴儀器，與半自動(dòng)測(cè)序儀法相比更易操作。此外，Kitashiba等［4］開(kāi)發(fā)出一種圓點(diǎn)雜交法鑒定果樹(shù)S基因型方法，但此方法過(guò)于靈敏，需要通過(guò)預(yù)備試驗(yàn)，獲得每個(gè)探針最適雜交溫度，否則會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。

我們?cè)?jīng)利用相似原理鑒定李子和櫻桃S基因型［13］。李子和櫻桃S基因型鑒定，既可以通過(guò)花粉自交不親和性因子SFB基因序列鑒定，也可以通過(guò)花柱自交不親和性因子S-RNase基因序列鑒定。本研究，我們又運(yùn)用該方法鑒定梨樹(shù)S基因型。梨樹(shù)S基因型只能根據(jù)S-RNase基因序列判斷，這主要是因?yàn)槔婊ǚ跾基因至今未被鑒定。在李子、櫻桃S基因型鑒定中，因?yàn)樵诟咦儏^(qū)存在500 bp以上內(nèi)含子，我們根據(jù)所有等位基因序列設(shè)計(jì)1個(gè)正向通用引物和多個(gè)等位基因特異反向引物，再利用多引物PCR擴(kuò)增梨品種S-RNase高變區(qū)。在多引物PCR中，存在引物之間相互影響，我們根據(jù)S-RNase基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)了1對(duì)通用引物，利用花柱RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為PCR模板，擴(kuò)增S-RNase基因高變區(qū)，不存在多引物干擾問(wèn)題，同時(shí)回避了多數(shù)梨S-RNase基因沒(méi)有內(nèi)含子序列的問(wèn)題。除秋榮外，所有品種都與2個(gè)探針呈陽(yáng)性反應(yīng)，結(jié)果與各品種的S基因型一致，表明該方法非常可靠。品種秋榮所含S4sm-RNase基因發(fā)生突變，在花柱中不表達(dá)，因此無(wú)法檢測(cè)到其信號(hào)。

在該方法中，用于檢測(cè)S基因型的探針都包含3段序列，第1段是與各S基因型對(duì)應(yīng)的等位基因互補(bǔ)序列，第2段是與地高辛標(biāo)記的檢測(cè)探針互補(bǔ)的檢測(cè)序列，第3段是分隔上述兩部分的間隔序列。S-RNase等位基因探針通過(guò)與地高辛標(biāo)記檢測(cè)探針雜交結(jié)合間接獲得地高辛標(biāo)記。通過(guò)這種設(shè)計(jì)，避免每個(gè)探針都用地高辛標(biāo)記，只需合成1個(gè)地高辛標(biāo)記的檢測(cè)探針，從而大大降低試驗(yàn)成本，尤其在多個(gè)探針時(shí)，更能體現(xiàn)出該方法的經(jīng)濟(jì)性。

雖然在我們?cè)囼?yàn)中，由于材料限制只選取了8個(gè)品種，7個(gè)S基因型，但我們?cè)谠O(shè)計(jì)引物和探針時(shí)，比較了數(shù)據(jù)庫(kù)中所有梨S基因型，保證各探針的特異性。在對(duì)梨品種S基因型進(jìn)行鑒定時(shí)，可將已經(jīng)公布的S等位基因分成多個(gè)組，以組為單位分別檢測(cè)，從而減少工作量。

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