夏 鵬，魏建超，陸瑩梅，武專昌，李蓓蓓，劉 珂，邵東華，邱亞峰，鐘登科，溫貴蘭，馬志永

裂谷熱病毒Gn蛋白主要抗原區(qū)的表達、純化及抗原性分析

夏 鵬1,2，魏建超1，陸瑩梅1，武專昌1，李蓓蓓1，劉 珂1，邵東華1，邱亞峰1，鐘登科3，溫貴蘭2，馬志永1

目的 通過原核表達系統(tǒng)制備裂谷熱病毒Gn片段主要抗原區(qū)蛋白，獲取純化蛋白，并分析抗原性。方法 將合成的裂谷熱Gn基因用PCR的方法擴增具有保護性抗原表位的兩段Gn1和Gn2，并將其定向插入原核表達質粒pColdⅠ中，構建重組表達質粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2，并將重組質粒轉化到BL21(DE3)感受態(tài)中，以IPTG誘導表達，SDS-PAGE分析表達蛋白和表達量，并利用His-tag Ni柱進行親和層析純化，Western-blot鑒定表達蛋白。結果 所構建的質粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2序列正確，SDS-PAGE檢測到目的蛋白，Western-blot顯示截斷的Gn蛋白具有很好反應原性。結論 成功純化了裂谷熱病毒Gn主要抗原區(qū)的表達蛋白。

裂谷熱病毒；Gn蛋白；原核表達；蛋白純化

1931年，在肯尼亞的大裂谷報道了一種在家畜間大面積爆發(fā)的烈性傳染病，同年分離出病毒，并被命名為裂谷熱病毒(Rift Valley fever Virus,RVFV)。裂谷熱的傳播主要是通過蚊子的叮咬，引起包括肯尼亞、南非、埃及、馬達加斯加、也門及阿拉伯半島等地大面積爆發(fā)的人獸共患病。1977年之前，RVF一直在非洲撒哈拉大沙漠以南地區(qū)的動物和人間傳播，但1977-1978年間在埃及的爆發(fā)則主要發(fā)生在人群中，報道18 000多病例，其中大約600人死亡。直到2000年前，此病主要在非洲的南部和東部地區(qū)流行，但2000年9月，中東地區(qū)的阿拉伯半島和也門也爆發(fā)此病，僅僅3個月就有1 087個疑似病例，其中121例死亡[1]。此后，非洲東部和南部及阿拉伯半島地區(qū)成周期性流行[2]。如今，世界各國動物性進出口貿易日益頻繁，而阿拉伯半島又毗鄰亞歐大陸，所以更應加強對RVF的檢疫，同時對RVF疫苗的研制也迫在眉睫。裂谷熱沒有特征性臨床癥狀，因此個別病例的診斷較為困難，但該病的大面積傳播有以下特征：大批母畜流產、新生幼畜的大批死亡，乃至人群的發(fā)病。目前的診斷方法主要是病毒分離、血清學和核酸技術等[3]。

RVFV屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae) 白蛉熱病毒屬(Phlebovirus)。RVFV基因組由3個節(jié)段的負鏈RNA組成,分別為L、M、S節(jié)段。S節(jié)段長度為1 690 nt, 利用雙向策略，反義鏈編碼核衣殼蛋白( N) ，正義鏈編碼一個非結構蛋白( NSs)，2個相向的開放閱讀框之間的基因間區(qū)域為91 nt[4]。L節(jié)段長6 404 nt反向編碼RNA依賴的RNA聚合酶也稱為L蛋白[5]，M節(jié)段長3 885 nt,反向編碼4個蛋白，其中2個主要蛋白為糖蛋白Gn和Gc，另外2個次要蛋白為14 kDa的非結構蛋白(NSm)和78 kDa的結構蛋白[6]。糖蛋白對于布尼亞病毒在高爾基體內的成熟具有重要作用，Gn和Gc蛋白參與高爾基體的定位過程。研究表明，Gn蛋白C端的48個氨基酸部位(包括20個氨基酸的跨膜區(qū)域和鄰近的蛋白C末端28個氨基酸) 就是RVFV的高爾基體定位信號，而Gc蛋白則通過物理作用與Gn蛋白相結合從而定位于高爾基體[7-8]。N蛋白是RVFV主要的免疫原，而病毒表面的Gn和Gc蛋白含有中和表位，也能刺激機體產生抗體[9-10]。

RVFV囊膜糖蛋白(G) 是由M基因片段編碼的，翻譯后修飾過程中裂解為兩個蛋白(Gn和Gc糖蛋白)[11]，是病毒的主要免疫原結構蛋白。因Gn片段全長為1 610 bp，在原核表達系統(tǒng)中不易表達和純化。根據Besselaar TG等報道的G蛋白的主要抗原區(qū)，結合DNAstar Protean軟件分析Gn片段其親水區(qū)、表面展示概率及主要抗原區(qū)，確定兩段主要抗原區(qū)Gn1 (480-1268)和Gn2(1371-1688)[14]。本研究分別構建pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2原核表達質粒，在BL21感受態(tài)細胞中，通過IPTG誘導表達截斷囊膜蛋白Gn1和Gn2，重組蛋白經Ni柱 His Band親和層析純化后，獲得純化蛋白。

1 材料與方法

1.1 質粒和菌種 大腸桿菌原核表達質粒pColdⅠ、大腸桿菌感受態(tài)DH5α和BL21(DE3)由本實驗室保存。

1.2 主要試劑和材料 In-Fusion? HD Cloning Kit試劑盒購置于Clontech，各種限制內切酶和Buffer購置于Fermentas公司，小提質粒試劑盒和DNA膠回收試劑盒購置于Axygen公司Ni NTA His Bindresin購自Novagen公司，氨芐青霉素和IPTG購置于Sigma公司，各種DNA marker均購置于天根生物公司，抗His標簽鼠源單抗，抗兔抗PVFV Gn多克隆抗體(本研究室制備和鑒定)，辣根過氧化物酶( HRP) 標記的羊抗鼠二抗購自Sigma公司，化學合成裂谷熱病毒M基因(GenBank ACCESSION ：DQ380206)連接于pUc57質粒，由Invitrogen公司合成得到M-pUc57。

1.3 引物的設計 通過DNAStar分析Gn基因的親水區(qū)、表面展示概率及主要抗原區(qū)，以M-pUc57質粒為模板用Primer Premier 5.0軟件設計上下游引物，用PCR的方法擴增具有保護性抗原表位的兩段Gn1和Gn2。

1.4 重組質粒的構建 以合成的裂谷熱M基因為模板，用PCR的方法擴增片段Gn1和Gn2，膠回收純化PCR產物，質粒pColdⅠ并用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切并純化，Gn1、Gn2分別于酶切純化后的質粒按In-Fusion? HD Cloning Kit試劑盒連接(優(yōu)點：盡可能多的減少質粒外源基因的插入)，并將重組質粒轉化到BL21感受態(tài)細胞中，涂板過夜挑取單克隆，搖菌提質粒PCR鑒定，最終測序確認。

1.5 誘導表達 取鑒定正確的陽性菌液，按1∶100轉接，37 ℃搖菌OD600至0.4～0.6之間，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，然后置于18 ℃搖菌24 h，取菌液離心，收集菌體沉淀。按菌體10 CV加入細菌裂解緩沖液重懸，置于冰上超聲(工作5 s，間歇5 s，功率4 HZ)共15 min。取未誘導的菌液、誘導未超聲的菌液、誘導超聲的上清、誘導超聲的沉淀，用15%的SDS-PAGE分析其蛋白表達形式。沉淀用30 mL的Binding緩沖液重懸，4 ℃過夜。

1.6 重組蛋白的純化 將誘導表達的蛋白，按照His-tag Ni柱進行親和層析純化說明書純化蛋白。用15%的SDS-PAGE檢測其純化效果。

1.7 Western-blot檢測重組蛋白的表達 重組蛋白在SDS-PAGE電泳后，0.24 A恒安電流下轉膜2 h，室溫封閉2 h，一抗分別為抗His標簽鼠源單克隆抗體(稀釋度為1∶5 000)和抗兔抗PVFV Gn多克隆抗體(稀釋度為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌3次，二抗為辣根過氧化物酶( HRP) 標記的羊抗鼠，其稀釋度為1∶10 000，二抗室溫孵育2 h，TBST孵育3次，加顯色底物顯色，觀察GN1和GN2的免疫原性。

2結 果

2.1 原核重組質粒的構建與鑒定 裂谷熱M基因全長3 885 bp，用特異性引物擴增M片段的Gn1(480-1268)、Gn2(1371-1688)，按In-Fusion? HD Cloning Kit試劑盒連接,質粒小提后，以質粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2為模板，分別以特異性引物擴增，DL2000 marker、 1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，分別得到預期大小相同的片段(見圖1)，最后送生物公司測序，比對NCBI序列100%一致。

A M: DL2000 marker; 1: PCR amplification of M-pUc57; 2: PCR amplification of pColdⅠ-Gn1.

B M: DL2000 marker; 1: PCR amplification of M-pUc57; 2: PCR amplification of pColdⅠ-Gn2.

圖1 Gn1、Gn2的PCR擴增鑒定

Fig.1 Identification of Gn1 and Gn2 by PCR

2.2 重組蛋白的誘導表達 將重組陽性質粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2轉化到BL21(DE3)中，37 ℃震蕩培養(yǎng)至生長對數(shù)期，再以終濃度1 mmol/L IPTG在18 ℃誘導24 h，取未誘導的菌液、誘導未超聲的菌液、誘導超聲的上清、誘導超聲的沉淀，用15%的SDS-PAGE電泳鑒定后分子量約為Gn1 Gn2分別約為30 kDa和13 kDa(見圖2)，與理論值一致且可以確定其表達在包涵體中。

M: Protein marker; 1: Lysate of BL21uninduced; 2: Supernatant of BL21(Gn1); 3: Pellet of BL21(Gn1); 4: Lysate of BL21(Gn1) induced with IPTG; 5: Lysate of BL21uninduced; 6: Supernatant of BL21(Gn2); 7: Pellet of BL21(Gn2); 8: Lysate of BL21(Gn2) induced with IPTG.

圖2 Gn1和Gn2蛋白表達形式的鑒定

Fig.2 Analysis of expression of Gn1 and Gn2 protein

2.3 重組蛋白的純化 經SDS-PAGE電泳表明，目的蛋白主要表達在包涵體內，于是對包涵體進行大量誘導表達，離心取菌體加裂解液，超聲后沉淀溶解在6 mol/L尿素Binding Buffer中于4 ℃過夜。對包涵體進行His-tag Ni柱進行親和層析純化，樣品進行SDS-PAGE顯示得到較高純度的蛋白(見圖3和圖4)。

M: Protein marker; 1: Lysate of BL21uninduced; 2: Supernatant of BL21(Gn1); 3: Pellet of BL21(Gn1); 4: Lysate of BL21(Gn1) induced with IPTG; 5-13: Purification of Gn1 recombinant protein.

圖3 Gn1重組蛋白的純化

Fig.3 Purification of Gn1 recombinant protein

M: Protein marker; 1-5: Purification of Gn2 recombinant protein.

圖4 Gn2重組蛋白的純化

Fig.4 Purification of Gn2 recombinant protein

2.4 純化蛋白的Western-bolt分析 對重組蛋白Gn1、Gn2進行Western-bolt鑒定，結果顯示分別在約30 kDa(見圖5)、13 kDa(見圖6)出得到特異性條帶。

M: Protein marker; 1: Empty vector PcoldⅠ; 2: Purification of Gn1 recombinant protein reacted with His Monoclonal antibody; 3: Purification of Gn1 recombinant protein reacted with ployclonal antibody.

圖5 Gn1重組蛋白的Western-bolt鑒定

Fig.5 Identification of Gn1 recombinant protein by Western-bolt

M: Protein marker; 1: Empty vector pColdⅠ; 2: Purification of Gn2 recombinant protein reacted with His Monoclonal antibody; 3: Purification of Gn2 recombinant protein reacted with ployclonal antibody.

圖6 Gn2重組蛋白的Western-bolt鑒定

Fig.6 Identification of Gn2 recombinant protein by Western-bolt

3 討 論

裂谷熱是由裂谷熱病毒引起的一種烈性人獸共患傳染病，蚊子是重要的傳播媒介，病毒可在蚊卵內存活幾十年[12]。我國目前還沒有發(fā)現(xiàn)裂谷熱的存在，但近年來，隨著中非貿易合作的加大，人員流動和交通運輸愈加頻繁，地域邊界和天然屏障已很難有效阻止蚊媒和病毒的入侵，傳入的風險也與日俱增，所以裂谷熱的防控一直備受關注。

布尼亞病毒的囊膜糖蛋白是由mRNA編碼的，所有的病毒均具有一個連續(xù)的閱讀框架，編碼糖蛋白的前體，再裂解為兩種糖蛋白( Gn和Gc)；囊膜糖蛋白的主要功能是與細胞表面的受體結合[13]。在裂谷熱病毒入侵宿主細胞的過程中，首先是細胞與裂谷熱病毒囊膜糖蛋白介導病毒相結合，再通過細胞膜與病毒囊膜融合過程。因為裂谷熱病毒缺乏基質蛋白，所以糖蛋白對病毒粒子的成熟和釋放起到至關重要作用。

裂谷熱病毒和其他RNA病毒一樣，在侵入宿主細胞、融合、與宿主細胞受體結合及中和抗體的誘導方面，裂谷熱病毒的囊膜糖蛋白起到關鍵作用。裂谷熱病毒具備其他反轉錄病毒一樣的特性，能和多種異源病毒膜蛋白形成偽型病毒的能力，糖蛋白Gn、Gc在高爾基體內積累，末端糖基化，獲得經過修飾的宿主膜，出芽進入高爾基池，或在細胞表面出芽；細胞質小囊與胞漿膜融合，釋放出成熟的病毒粒子。

本研究通過人工合成的方法，合成了裂谷熱病毒的Gn基因，并通過DNAStar Protean軟件分析其親水區(qū)、表面展示概率及主要抗原區(qū)，找出主要抗原區(qū)，以人工合成的Gn為模板，設計特異性引物分別擴增基因Gn1和Gn2。并將其插入到原核表達質粒pColdⅠ中，構建重組表達質粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2，表達純化糖蛋白，通過SDS-PAGE和Western-blot檢測，表達的原核蛋白具有良好的抗原性，可以被特異性抗體識別。本研究表達純化的裂谷熱的糖蛋白Gn，為后續(xù)裂谷熱的ELISA檢測奠定了基礎。

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Expression, purification and antigenicity analysis of the major antigenic region of Gn protein from Rift Valley fever virus

XIA Peng1,2,WEI Jian-chao1,LU Ying-mei1,WU Zhuan-chang1,LI Bei-bei1,LIU Ke1,SHAO Dong-hua1,QIU Ya-feng1,ZHONG Deng-ke3,WEN Gui-lan2,MA Zhi-yong1

(1.ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai200241,China;2.CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China;3.DepartmentofAnimalScienceandTechnology,ShanghaiVocationalandTechnicalCollegeofAgricultureandForestry,Shanghai201600,China)

We expressed the protein of major antigenic region of Gn fragment of Rift Valley fever virus using prokaryotic expression system, and then purified the obtained protein for analyzing its antigenicity. The synthesized Gn gene was amplified with PCR and sub-cloned to generate pColdⅠ-Gn1 and pColdⅠ-Gn2 recombinant plasmid, which was then transformed intoE.coliBL21(DE3) competent bacteria. The expression of recombinant protein was induced by IPTG and analyzed by SDS-PAGE. The expressed protein was purified using His-Band Ni+ affinity chromatography and identified by Western blot. The recombinant expression plasmid was expressed successfully and the recombinant protein had good antigenicity by western-bolt. In conclusion, successfully expression and purification on the protein of major antigenic region of Gn fragment from Rift Valley fever virus laid the foundation for the follow-up study.

Rift Valley fever virus; Gn protein; prokaryotic expression; protein purification

Ma Zhi-yong, Email: zhiyongma@shvri.ac.cn

國家科技支撐計劃(2013BAD12B05); 國家自然科學基金(31302116);上海高校青年教師培養(yǎng)資助計劃(ZZnlzl2003)和上海農林職業(yè)技術學院院級科研項目(091227)

馬志永，Email: zhiyongma@shvri.ac.cn

1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241; 2.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025; 3.上海農林職業(yè)技術學院，上海 201600

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.003

R183.5

A

1002-2694(2015)07-0607-05

2014-11-10；

2015-05-12

Supported by grants from the National Science and Technology Support Program of China (No. 2013BAD12B05), the National Natural Science Foundation of China (No. 31302116), the Development Program for Young Teachers in Shanghai Colleges (No. ZZnlzl2003), and the Science Foundation of Shanghai Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry (No. 091227)