張 穎 龔 達 辛 毅 崔 巍 劉潔琳 萬居易 劉 颯 李殿坤 杜蘭平 辛志飛 許秀芳李溫斌 (首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院，北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029)

戊二醛是一種蛋白交聯(lián)劑，廣泛用于處理生物瓣膜、生物血管和心包等［1-3］。T 細胞活化和巨噬細胞是細胞免疫介導的急性器官移植排斥反應早期過程中的主要環(huán)節(jié)［4-6］。機體的防御體系包括天然免疫(固有免疫)和獲得性免疫。前者作用迅速，通過許多途徑和機制來保護自己免受有害物質的侵襲。

先天性免疫生來就有，是遺傳的。它是機體在長期種系發(fā)育和進化過程中不斷地與入侵的微生物做斗爭而逐漸建立起來并傳給后代的。參與異種免疫排斥的固有免疫細胞種類很多。單核細胞和中性粒細胞在移植后早期迅速浸潤移植器官，但主要發(fā)揮免疫效應的是巨噬細胞和NK 細胞等。單核吞噬細胞包括血液中的單核細胞和組織器官中的巨噬細胞，是異種器官植入后早期浸潤移植物的炎癥細胞，對移植物內皮細胞具有顯著的黏附和殺傷效應，此效應機制十分復雜。固有免疫細胞發(fā)揮免疫效應，特別是激活和損傷移植器官內皮細胞時，需要天然抗體和補體的存在，目前一些研究卻表明固有免疫細胞可獨自識別并激活異種內皮細胞［7-11］。

本實驗主要研究異種(豬)血管大鼠皮下包埋不同時間點新鮮未處理組和戊二醛組巨噬細胞CD68、補體C3、先天性抗體IgG 等變化，探討這些指標在排斥反應中的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要動物及試劑 一抗:兔抗大鼠CD68 單克隆抗體(英國Abcam 公司)，C3 兔抗人多克隆抗體(中杉金橋生物技術有限公司)，鼠抗人IgG 單克隆抗體(博士德生物工程有限公司);EnVision 兩步法試劑盒(Dako REALTMEnVisiontm Detection SystemPeroxidase/DAB+，Rabbit/Mouse)為DAKO 公司(丹麥)產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 TB-718 生物組織包埋機;Leica RM2235 組織切片機(德國);Leica HI1220 烤片機(德國);Leica ST5020 全自動組織脫水機(德國);Olympus bx51 顯微鏡(日本)。

1.2 HE 染色 按照常規(guī)HE 染色方法染色。

1.3 免疫組化二步法染色 (1)將切片脫蠟至水:二甲苯Ⅰ15 min;二甲苯Ⅱ15 min;100%酒精Ⅰ10 min;100%酒精Ⅱ5 min;95%酒精5 min;90%酒精5 min;80%酒精5 min;70%酒精5 min;蒸餾水洗10 min×2 次;(2)抗原修復:枸緣酸緩沖液放入高壓鍋，水開后放入切片。蓋好鍋蓋，繼續(xù)加熱，噴氣后計時2 min，同時改用中火(140℃～160℃)，2 min后關火，馬上放氣，打開鍋蓋降溫至室溫;(3)PBS洗3 次，每次2 min。(4)雙氧水封閉:3%H2O2室溫10 min(注意避光)，再用PBS 洗3 min ×3 次;(5)滴加一抗(C3 抗體稀釋度為1∶500，其余抗體稀釋度為1∶400)，4℃冰箱過夜;(6)取出切片，室溫下放置30 min，PBS 溶液洗3 min×3 次;滴加二抗:室溫30 min;(7)顯色反應:先PBS 溶液洗3 min ×2次，再室溫DAB 顯色1～5 min，顯微鏡下觀察，觀察目標出現(xiàn)陽性后，蒸餾水洗終止反應;(8)自來水充分沖洗，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，氨水返藍;(9)脫水透明:70%酒精3 min×1 次;80%酒精3 min×1 次;90%酒精3 min×1 次;95%酒精3 min×1 次;100%酒精Ⅰ3min;100% 酒精Ⅱ3 min;二甲苯Ⅰ3min;二甲苯Ⅱ3 min;(10)中性樹膠封片;(11)采集圖像及圖像分析:高倍鏡下拍攝10 個視野，將采集的圖像應用Image-pro Plus 5.1 圖像分析系統(tǒng)進行分析，所得數(shù)據(jù)作免疫組織化學染色陽性信號累積光密度(IOD)，以IOD 值作為組織表達的定量標準。累積光密度(IOD)=平均光密度(AOD)×陽性面積(A)。

1.4 統(tǒng)計學處理 利用SPSS18 統(tǒng)計軟件進行動物實驗兩組皮下包埋移植后各時間點的各指標參數(shù)均值和標準差;所有數(shù)據(jù)以±s 表示，并利用t 檢驗分別進行參數(shù)間的顯著性檢驗，設定P ＜0.05 時具有顯著性差異。用GraphPad Prism 5 進行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結果

2.1 HE 染色結果 HE 染色結果顯示:新鮮組術后可見大量細胞，尤其是術后第12 天最明顯，其次是術后第30 天;戊二醛組比較新鮮組術后細胞數(shù)較少。見圖1。

2.2 CD68 免疫組化 CD68 免疫組化結果顯示:新鮮組術后第12、30 天染色較深，反映排斥反應較強，而術后第60 天排斥明顯減弱。戊二醛組術后第4、12、30、60 天比新鮮組明顯減弱。見圖2。

圖1 新鮮組和戊二醛組HE 染色Fig.1 HE staining results of fresh group and glutaraldehyde group

2.3 C3 免疫組化 C3 免疫組化結果顯示:戊二醛組術后第4 天和第60 天比新鮮組明顯減弱，術后第12 天變化不明顯。見圖3。

2.4 IgG 免疫組化 IgG 免疫組化結果顯示:新鮮組術后第12、30 天染色較深，反映排斥反應較強，而術后第60 天排斥明顯減弱。戊二醛組術后第4、12、30、60 天比新鮮組明顯減弱。見圖4。

2.5 CD68、C3 和IgG IOD 值變化趨勢 高倍鏡下拍攝10 個視野測量IOD 值結果顯示:新鮮組術后第4 天IOD 值開始上升，到第12 天或第30 天升高到峰值，術后第60 天降低。戊二醛組與新鮮組相比，IOD 在各個時間點均較低。見圖5。

圖2 新鮮組和戊二醛組CD68 免疫組化Fig.2 CD68 immunohistochemistry results of fresh group and glutaraldehyde group

圖3 新鮮組和戊二醛組C3 免疫組化Fig.3 C3 immunohistochemistry results of fresh group and glutaraldehyde group

圖4 新鮮組和戊二醛組IgG 免疫組化Fig.4 IgG immunohistochemistry results of fresh group and glutaraldehyde group

圖5 新鮮組和戊二醛組CD68、C3 和IgG 術后4、12、30、60 天IOD 變化趨勢Fig.5 Changes of CD68，C3 and IgG in fresh group and glutaraldehyde group at 4th，12th，30th，60th day after operations

3 討論

異種來源的心血管替代材料在植入人體前，均需要一定的交聯(lián)處理以增強組織穩(wěn)定性及降低免疫原性，但是戊二醛是一種蛋白交聯(lián)劑，它可使膠原蛋白和彈性蛋白分子內及分子間形成穩(wěn)定的交聯(lián)鍵，封閉原有的抗原決定簇，從而降低生物移植材料中彈性纖維和膠原纖維的抗原性［1，2］。戊二醛是目前臨床上較為常用的生物移植材料處理劑，廣泛用于處理生物瓣膜和生物血管，以降低彈性纖維和膠原纖維的免疫原性，但是戊二醛處理的血管平滑肌和內皮細胞完全保留。血管平滑肌和內皮細胞仍具有較強的抗原物質。戊二醛具有以下缺點:如不能穩(wěn)定有效穩(wěn)定彈力纖維、導致鈣化和血栓。經(jīng)其處理的材料遠期易出現(xiàn)鈣化、退行性變和機械強度下降等不良改變，最終導致移植物衰敗，其中彈力纖維破壞與鈣化是血管移植物衰敗的重要原因之一。Isenburg 等［3］認為戊二醛能有效固定膠原纖維，卻不能穩(wěn)定彈力纖維，而未經(jīng)交聯(lián)的異種彈力纖維植入人體后易受基質蛋白酶攻擊而降解，加重局部炎癥反應和鈣化程度。研究表明主要原因是戊二醛主要通過結合蛋白質(如膠原纖維)中的賴氨酸殘基中的ε-氨基團形成共價鍵，起交聯(lián)作用，而彈力纖維中賴氨酸含量極少，故戊二醛對其交聯(lián)效果差［12，13］。戊二醛還可與膠原蛋白中羥脯氨酸等的羥基作用形成縮醛，生成較牢固的交聯(lián)鍵，通過以上兩種反應，形成膠原分子的分子內交聯(lián)與分子間交聯(lián)。另外，戊二醛產(chǎn)生的游離醛基具有細胞毒作用，直接影響了生物瓣的生物相容性。

Moura 等［14］研究60 只兔子，30 只自體靜脈移植，30 只0.19%戊二醛處理同源靜脈移植1 h。每一組(n=10)分為術后24 h、14 d 和28 d。結果顯示:在移植14 d 和28 d 觀察到纖維化，腔靜脈造影顯示兩組在血栓數(shù)量無明顯差異。在第14 天和28天，組織切片顯示內膜增生和分布兩組相似，電鏡顯示24 h 在移植物表面缺少內皮細胞，存在炎癥細胞，在一些區(qū)域，兩組都存在附壁血栓。兩組在第14 天和28 天顯示內皮細胞覆蓋移植物表面?zhèn)冢采w面積自體移植組比戊二醛處理組大。這項研究表明戊二醛處理的靜脈可作為靜脈重建替代物。

Sánchez［15］研究證實增加戊二醛濃度來固定心包，能提高機械性能，但是沒有增加鈣化潛能。新鮮心包處理:戊二醛0.625% 處理7 d (標準)，0.625%，1%和3%在4℃處理20 d 和50℃處理另外20 d，固定心包，小鼠皮下包埋50 d，結果顯示:3%戊二醛和熱處理及3%戊二醛處理后機械性能均超過標準水平，鈣化方面無明顯變化。應該聯(lián)合其他降低鈣化方法來處理心血管移植物。

免疫反應包括固有免疫反應和適應性免疫反應。固有免疫系統(tǒng)是人體對內源性和外源性致病原產(chǎn)生免疫應答和急性炎癥反應的第一道防線［16］。它是機體在長期與外界不斷侵人的病原物質相互斗爭過程中，逐步進化而建立起來對病原起防御作用的免疫功能，這種免疫功能比特異性免疫更加穩(wěn)定，并可遺傳給下一代。其主要特點是作用快、范圍廣，第一次與異物相遇即發(fā)生反應，起到首先防御作用。如與相應抗原再次相遇，反應并不減弱也不增強。固有免疫系統(tǒng)是由屏障結構、固有免疫細胞和固有免疫分子組成。包括:①機體的天然屏障，如皮膚、纖毛等;②參與免疫反應的細胞，如單核、巨噬細胞、天然殺傷細胞(NK)、樹突狀細胞(DC)等，其中巨噬細胞是非特異性免疫的重要組成部分，而且也在特異性免疫中也占重要地位;③固有免疫分子:參與免疫反應的活性物質，如補體(如C3 等)、天然抗體(IgG 等)、溶菌酶、干擾素等。先天性免疫應答的特征是:①無特異性，作用廣泛;②先天具備;③初次與抗原接觸即能發(fā)揮效應，但無記憶性;④可穩(wěn)定遺傳;⑤同一物種的正常個體間差異不大。

巨噬細胞(CD68)是體內具有最活躍生物學功能的細胞類型之一，可產(chǎn)生數(shù)十種酶、分泌百余種生物活性物質，在免疫防御、免疫自穩(wěn)和監(jiān)視、抗原遞呈及免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用。參與并部分介導異種移植排斥反應，雖然激活的巨噬細胞對于移植物的排斥是非常關鍵的，但是如果沒有活化T 細胞的存在，巨噬細胞的定向聚集過程和活化不能完成［9，10］。

天然抗體是指在沒有任何抗原主動免疫的情況下，正常機體內天然產(chǎn)生存在的一種免疫球蛋白。天然抗體在維護機體免疫狀態(tài)平衡、調節(jié)生理機能、防御感染、移植、監(jiān)視腫瘤等多方面具有重要的意義［17-19］。

補體由一組血清蛋白組成，這些蛋白序貫相互激活產(chǎn)生生物活性分子［20，21］。

補體在序列活化過程中所釋放出的一些遞質及活性片段可直接破壞移植物。補體參與急性、慢性以及超急性排斥反應。另外抗體分子與抗原結合后活化補體，使其更為準確、集中、有效地殺傷靶細胞并且介導殺傷性細胞和巨噬細胞的抗體依賴的細胞毒效應(ADCC)。

我們的實驗觀察到異種血管CD68、C3 和IgG在術后第12 天、30 天染色較強，排斥反應強，戊二醛組以上指標術后第12 天、30 天染色比新鮮組較弱。我們得出結論:戊二醛固定的異種血管免疫原性下降，但是仍然具有免疫原性，綜上所述，尋找新型交聯(lián)劑以及新的降低免疫原性的解決方法變得更為迫切，需要探索更好的方法來明顯削弱排斥反應。

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