王 光，孫艷朋，王利華

（青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東 青島 266109）

氮是構成微生物細胞蛋白和核酸的重要成分。微生物氮的來源可分為無機氮和有機氮，其中無機氮易溶解又有利于吸收；有機氮除含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽和游離氨基酸外，還含有少量糖、脂肪、微量元素及維生素、生長素等營養(yǎng)物質(zhì)[1]。江微等分別用等量的無機氮源和復合有機氮源代替原培養(yǎng)基中的尿素，結果表明，釘子菇對復合氮源利用最好，菌絲生長旺盛，濃密潔白，與無機氮源差異顯著[2]。而朱永真等的研究表明，尿素為羊肚菌的最優(yōu)氮源，其次是硝酸鉀和硝酸鈣，然后才是酵母膏等有機氮源[3]。

瘤胃真菌在反芻動物瘤胃中纖維物質(zhì)分解消化過程中發(fā)揮重要的作用[4]。氮源影響真菌生長，而瘤胃真菌又可以產(chǎn)生纖維素酶，所以本試驗研究酵母膏、菌糠、氯化銨、硫酸銨以及尿素作為真菌生長所需的氮源，以羧甲基纖維素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活性和發(fā)酵液pH 值的變化為指標，來探討氮源對瘤胃真菌產(chǎn)纖維素酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株 本試驗采用的瘤胃厭氧真菌取自裝有永久性瘤胃瘺管的嶗山奶山羊，用真菌培養(yǎng)基稀釋10 倍，39 ℃培養(yǎng)3 d 后獲瘤胃真菌產(chǎn)酶接種用菌株。

1.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)基及試驗設計 產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配置參照朱崇淼[5]方法，發(fā)酵底物用花生蔓代替。

試驗分6 個處理組，分別用相同質(zhì)量的供試氮源（酵母膏、菌糠、氯化銨、硫酸銨、尿素）代替產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的蛋白胨，以不加氮源為對照。

1.3 測定項目和方法 各處理組分別稱取發(fā)酵底物花生蔓0.5 g，裝入封口袋中，然后依次加入45 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基和5 mL 培養(yǎng)3 d 的真菌培養(yǎng)液，每個處理設3 個重復。完畢后擠凈封口袋中空氣并封口，放入39 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，發(fā)酵時間分別為0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h。在各時間點發(fā)酵結束，迅速從各封口袋中抽取適量發(fā)酵液上清，備測酶活性，酶活性測定方法參照朱崇淼[5]、王建等方法[6]。

在各個發(fā)酵時間點，用pH 計測定發(fā)酵液中的pH 值。

1.4 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)均采用SAS軟件中的Glm 過程對氮源、培養(yǎng)時間及二者的互作效應進行方差分析，并針對每種氮源的不同培養(yǎng)時間、每個培養(yǎng)時間點不同氮源進行方差分析，用Duncan 氏SSR 進行多重比較。檢驗誤差為5%水平。

2 結果與分析

2.1 木聚糖酶活性測定結果 由表1 可知，不同氮源及培養(yǎng)時間對木聚糖酶活性影響顯著，而且二者的互作顯著（P＜0.001）。木聚糖酶活性達到最高點的時間大致在48 h 或是72 h，5 種氮源組的纖維素酶活性均顯著高于對照組（P＜0.05），其中又以氯化銨組的酶活性為最高，顯著高于其他試驗組（P＜0.05）。24 h 時有機氮源組的木聚糖酶活性高于無機氮源組，48 h 后無機氮源組木聚糖酶活性迅速升高，并超過有機氮源組達到最高酶活性。培養(yǎng)72 h 氯化銨組、硫酸銨組、菌糠組及酵母膏組的酶活性均達到高峰，但氯化銨組的酶活性顯著高于其他各氮源組（P＜0.05）。

2.2 羧甲基纖維素酶活性測定結果 表2結果表明，不同氮源及培養(yǎng)時間對羧甲基纖維素酶活性影響顯著，而且二者的互作顯著（P＜0.001）。48 h 時，硫酸銨組和酵母膏組酶的活性達到高峰，但與其他氮源組相比差異不顯著（P＞0.05）。72 h 時，氯化銨組、菌糠組和尿素組酶活性達到最高，氯化銨組與尿素組的酶活性無顯著差異（P＞0.05），但氯化銨組酶活性顯著高于其他各時間點及各氮源組（P＜0.05）。

表1 不同氮源對木聚糖酶活性的影響

表2 不同氮源對羧甲基纖維素酶活性的影響

2.3 β-葡萄糖苷酶活性測定結果 不同氮源及培養(yǎng)時間對β-葡萄糖苷酶活性影響顯著，而且二者的互作顯著（P＜0.001）。β-葡萄糖苷酶活性變化趨勢與羧甲基纖維素酶大致相同（見表3），不同之處在于48 h 時，尿素組β-葡萄糖苷酶活性最高。72 h 時，氯化銨組的β-葡萄糖苷酶活性達到最高峰，與酵母膏差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其他各氮源組（P＜0.05）。

2.4 不同氮源組pH值變化結果 由圖1 可知，各組pH 值隨著時間增長逐漸下降，5 種氮源組120 h 的pH值下降值與對照組相比差異顯著（P＜0.05），其中以菌糠組下降最快，相比0 h 時下降了0.86。酵母膏組和尿素組次之，二者之間差異不顯著（P＞0.05）。氯化銨組和硫酸銨組pH 值差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 不同氮源對纖維素酶活性的影響 對照組的最高纖維素酶活性遠遠低于5 種氮源組，證明了氮源對厭氧真菌生長的重要性。本試驗還發(fā)現(xiàn)瘤胃厭氧真菌對無機氮源的利用效果要優(yōu)于有機氮源。Dijkerman 等報道，Piromyces E2 菌在以銨鹽為氮源時生長最好，以谷氨酸、清蛋白、尿素等為氮源時，該菌的生長效果不好[7]。松乳菇對NH4+-N 和NO3--N 都能加以較好地利用，而其他外生菌和真菌利用NO3--N 的能力較差[8]。史宏志等研究表明，在中等施氮水平下，無機氮比例較大時有利于提高淀粉酶的活性[9]。但也有一些學者認為氨基酸類氮源比銨鹽更有利于真菌生長，而且可以直接合成真菌所需的蛋白質(zhì)[10]。白愛枝等認為以NaNO3為單一氮源時，72 h 木聚糖酶活力可達211.0 IU/mL，而且一般復合氮源對木聚糖酶產(chǎn)量的提高有利[11]。

表3 不同氮源對β-葡萄糖苷酶活性的影響

圖1 不同氮源在不同培養(yǎng)時間對發(fā)酵液pH 值的影響

從本試驗測得的酶活性大小看，遠不如Wood等和Lee 等所報道的數(shù)據(jù)[12-13]。分析原因可能是與菌種差異及不同的發(fā)酵工藝有關，本試驗所用發(fā)酵底物為粗纖維含量較高的花生蔓，沒有添加玉米、麥麩等碳源。

3.2 不同氮源對發(fā)酵液pH 值變化的影響 體外培養(yǎng)時發(fā)酵液pH 值的變化受發(fā)酵底物，有機酸積聚以及氮源的影響。植物纖維素在消化道內(nèi)被分解為纖維二糖，再由6-磷酸葡萄糖經(jīng)過一系列過程生成丙酮酸，丙酮酸再生成丙酸及其他揮發(fā)性脂肪酸。厲學武等研究表明，在培養(yǎng)液中按培養(yǎng)底物秸稈添加2%篩選的瘤胃厭氧真菌可顯著提高培養(yǎng)液中菌體蛋白和揮發(fā)性脂肪酸含量[14]。能量飼料發(fā)酵后會產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，蛋白飼料發(fā)酵后會產(chǎn)生一定量的NH3-N[15]。本試驗表明，菌糠組pH 值下降最為明顯，可能是菌糠相比其他氮源成分比較復雜（粗蛋白7.5%、粗脂肪7.2%、粗纖維45.16%、粗灰分11.3%、無氮浸出物38.19%），發(fā)酵時無氮浸出物可能被分解成有機酸，pH 值下降顯著。

4 結論

添加不同氮源對瘤胃厭氧真菌產(chǎn)纖維素酶有一定的影響。從本試驗的結果來看，以氯化銨做氮源可以產(chǎn)生較高活性的纖維素酶；不同氮源對發(fā)酵液pH 值也有影響，其中菌糠的影響最為明顯。

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