王衛(wèi)霄 呂艷茹 姚苗苗 張曉靜 杜曉欣 趙素芬

靈芝［Ganoderma Lucidum(Fr.)Karst］是一種珍貴的藥用真菌，屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬(Ganoderma)，又稱“靈芝草”、“仙草”、”長生草”，在我國有悠久的藥用歷史［1］。傳統(tǒng)中醫(yī)視之為名貴滋補(bǔ)類藥材，有扶正固本、延年益壽之功效。靈芝孢子(Ganoderma lucidum spore)是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來極其細(xì)小的種子，為靈芝的生殖細(xì)胞，是靈芝的精華部分，具有靈芝的全部遺傳活性物質(zhì)，主要有效成分除多糖類、三萜類、肽類，還富含多種氨基酸、寡糖、脂肪酸以及微量元素。靈芝孢子是靈芝的一種繁殖結(jié)構(gòu)，具有堅韌的外壁，破壁后更有利于機(jī)體的吸收，其中含有比靈芝更豐富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白質(zhì)、酶類、硒元素等特殊成份，其藥理作用主要有抗腫瘤［2－4］，抗炎、保肝、降血清膽固醇、降血糖、抗輻射、增強(qiáng)免疫功能［5］，抗病毒作用［6］，并對神經(jīng)、心血管和呼吸系統(tǒng)有調(diào)節(jié)改善作用。有研究表明靈芝孢子粉可增強(qiáng)免疫功能，并對多種移植性動物腫瘤有明顯的抑制作用［7，8］。近年來，對靈芝孢子粉的抗腫瘤研究和利用越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，尤其在加拿大、美國以及亞洲國家如中國、韓國、日本對其有較為深入的研究。本文對靈芝孢子在腫瘤治療方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 靈芝及靈芝孢子的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)性狀

我國現(xiàn)有靈芝屬真菌66種，分布于我國多達(dá)23個省市，多為野生，主要有靈芝(Ganoderma lucidum)(又名紅芝、赤芝)，紫芝(G.Japonicum)即中國靈芝，薄蓋靈芝(G.Capense)，樹舌芝(G.Applana2tum)，云芝(G.Polystictus)等。其中以靈芝和紫芝藥用價值最高，被視為珍貴的中藥材。在《中華人民共和國藥典》上收入作為藥材靈芝來源的是赤芝［Ganoderma lucidum(Leys.exFr.)Karst］或紫芝［Ganoderma japonicum(Fr.)Lloyd］［9］。目前國家衛(wèi)生部已批準(zhǔn)靈芝為食品新資源;《美國草藥藥典與治療概要》也收載了靈芝。

靈芝孢子是靈芝的種子細(xì)胞呈褐色卵形，大小為(8.5～11.2)μm ×(5.2～6.9)μm(1～2)μm，細(xì)胞壁是極其堅固的雙層結(jié)構(gòu)骨架，褐色內(nèi)層壁上有許多針狀小突起伸入透明光滑的孢子壁外層［10］。

靈芝孢子內(nèi)含有比靈芝更豐富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白質(zhì)、酶、三萜類、有機(jī)鍺、微量元素等成分［11］，其所含有的靈芝多糖、靈芝酸、有機(jī)鍺、有機(jī)硒等營養(yǎng)物質(zhì)是靈芝子實體的數(shù)十倍，并且其在增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和抑制腫瘤的藥效方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其母體靈芝［7，12－14］。

2 靈芝孢子的破壁

組成靈芝孢子細(xì)胞壁的物質(zhì)為幾丁質(zhì)和肽聚糖(PePtdoglycan)，由于聚糖鏈上所存在的肽鍵數(shù)量多，交聯(lián)程度緊密致使結(jié)構(gòu)十分致密，導(dǎo)致強(qiáng)度很高，質(zhì)地堅硬，且耐酸堿。靈芝孢子粉的活性部位主要在壁內(nèi)，服用未破壁的靈芝孢子后必須依靠胃酸和人體的生物酶的作用，將細(xì)胞壁溶解后，孢子細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)才能被人體所吸收。因為孢子細(xì)胞在人體內(nèi)停留時間有限，限制了人們對孢子內(nèi)有效物質(zhì)的消化吸收，極易造成孢子細(xì)胞的浪費;同時也限制了對其化學(xué)成分及生物活性成分的研究。為利于孢子細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)在人體內(nèi)快速釋放而達(dá)到充分利用靈芝孢子內(nèi)的有效物質(zhì)以提高藥效的目的，須對靈芝孢子進(jìn)行破壁處理，破壁處理后的孢子壁則殘缺不全，內(nèi)容物呈不規(guī)則團(tuán)塊狀。

采用物理手段及一般的化學(xué)方法很難破壞靈芝孢子的雙層壁，有效的靈芝孢子破壁方法可以促進(jìn)其生物活性成分的提取及藥用價值的研究。常用的破壁方法有酶法、振動磨法和超微粉碎法［15］，過冷液氮淬冷法［16，17］，低溫玻璃化破碎法［17］等。李淑芳等［18］利用萌發(fā)破壁法、超微粉碎法、酶解法這三種方法的綜合法破壁，取得滿意的破壁率。洪亮［19］采用超音速氣流破壁法破壁可使靈芝孢子粉破壁率達(dá)到98%以上，該法破壁的靈芝孢子醇提物及水提取物的抗氧化活性比未破壁者明顯升高。破壁后醇提取物的DPPH(1，1-二苯基苦基苯肼)、ABTS(2，2’-偶氮-雙(3-乙苯基-噻唑啉-6-硫酸)和羥自由基清除率的EC50較未破壁靈芝孢子粉分別低 46.53%、77.11% 和 69.51%，F(xiàn)RAP 值和ORAC值分別高出287.87%和30.18%。倪江洪等［20］的研究中破壁孢子提取液的多糖含量明顯高于不破壁孢子，而且破壁孢子中多糖更容易提取。鮑幸峰［21］等研究了破壁前后靈芝孢子粉多糖的提取，提示在37℃、沸水浴及水煮條件下，破壁比未破壁孢子的多糖釋放能力分別強(qiáng)118.4%、87.5%和69.6%。

3 靈芝孢子的生物活性物質(zhì)及其抗癌活性

靈芝所含化學(xué)成分復(fù)雜，目前已知的有糖類(還原糖和多糖)、氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、甾類、三萜類、揮發(fā)油、香豆精苷、生物堿、樹脂、油脂、多種酶類、微量元素等。包括了人體所必須的營養(yǎng)物質(zhì)，同時還是人體健康所必需的膳食纖維的很好來源。

靈芝的有效化學(xué)成分一直是人們關(guān)注的焦點?，F(xiàn)已知靈芝多糖類化合物和靈芝三萜類化合物是靈芝的關(guān)鍵藥效成分［22］。其成分分為醇溶性和水溶性兩種，醇溶性物質(zhì)為靈芝孢子油，其中脂肪酸占70%左右(大部分是不飽和脂肪酸)，三萜類物質(zhì)占20%左右;水溶性物質(zhì)主要為靈芝多糖類化合物。

3.1 靈芝孢子粉多糖 靈芝孢子粉多糖(Ganoderma Lucidum spore polysaccharide)是靈芝孢子粉的主要有效成分，是靈芝孢子重要藥理活性的體現(xiàn)者，具有多種藥理學(xué)活性。靈芝孢子粉多糖的相對分子質(zhì)量在50 000以上，主要以 β-葡聚糖為主［12，23］。此外，還有甘露葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖、肽多糖、雜多糖、半乳葡聚糖等。

靈芝多糖具有抗腫瘤及提高肌體免疫活性的功能［24，25］，是靈芝具有扶正固本的主要有效成分。靈芝多糖的抗腫瘤作用最初發(fā)現(xiàn)于移植性肉瘤小鼠的腹水中［26］。多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)與其生物活性功能關(guān)系密切，當(dāng)多糖的分子量＞1×104時才顯示出強(qiáng)的抑制腫瘤的活性，且α-葡聚糖和β-葡聚糖的抗癌功能也有區(qū)別，α型結(jié)構(gòu)多無活性［27］，其在主鏈上的取代度和側(cè)鏈長度(且活性強(qiáng)弱與多糖鏈支的程度及支鏈上羥基取代的數(shù)量)是決定水溶液中的構(gòu)象和β-D-(1-3)葡聚糖具有生物活性的非常重要的因素［28，29］。靈芝多糖的抗癌活性是通過與β-葡聚糖結(jié)合的補(bǔ)體受體3(CR3)介導(dǎo)的［30］。倪惠芳等［31］試驗，2 組小鼠分別先服靈芝多糖和蒸餾水，然后在其足趾上接種肺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞，再連續(xù)給服靈芝多糖和蒸餾水，連續(xù)服10 d，結(jié)果服靈芝多糖鼠足趾肺癌細(xì)胞瘤重為0.52 g，腸癌細(xì)胞瘤重為0.475 g，而對照組瘤重分別為1.21 g和0.945 g，靈芝多糖對腫瘤的抑制率達(dá)50%以上。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)服過靈芝多糖的小鼠血清中含有豐富的腫瘤免疫因子如白細(xì)胞介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和干擾素(rIFN)，表明靈芝多糖是通過提高機(jī)體腫瘤免疫因子抑制腫瘤生長。李建軍等［8］給Balb/c小鼠皮下接種 S-180肉瘤后，靈芝提取物(GLE)5、10、20 g(生藥)/kg 及靈芝多糖灌胃，共10 d，可顯著抑制 S-180肉瘤生長，其抑瘤率分別為22.77%、41.58%和 60.89%。靈芝多糖與環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)并用還能增強(qiáng)后者的抗腫瘤作用。

靈芝多糖可以通過刺激自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答而激活宿主的免疫反應(yīng)而抑制了腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移［32］。靈芝多糖具有化學(xué)預(yù)防作用，這種作用是通過誘導(dǎo)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)的活性來調(diào)節(jié)的［33］。有研究發(fā)現(xiàn)靈芝的不同部位提取出來的靈芝多糖的抗腫瘤活性也不相同［34］。

3.2 三萜類化合物 三萜類化合物是靈芝中另一類主要的有效成分，是靈芝藥用功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一［35］，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為高度氧化的羊毛甾烷衍生物，具有較高的脂溶性，分子量一般為400～600。三萜類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，目前已知有7種不同的母核結(jié)構(gòu)，在母核上有多個不同的取代基，常見有羧基、羥基、酮基、甲基、乙酰基和甲氧基等。由于靈芝三萜類成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性，并且其種類多，化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣，因此其具有較廣泛的藥理作用［36，37］，如保肝、抗腫瘤、抗微生物、抗高血壓;抗HIV-1及HIV-l蛋白酶活性;抑制組胺釋放;抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶;抑制血小板聚集;抗氧化等重要作用［38］。

三萜類萜烯酸是其主要苦味成分［39］，如靈芝酸(gandenic acid)A、B、C、D、E、G、I、L、α、DM、ma、mb、mc、md、mg;赤芝酸(lucidunic acid)A、B、C、D、E、F、O;tsugaric acid A、B。首次分離到三萜類化合物的主要成分靈芝酸A(ganodericacid A)和靈芝酸B(ganodericacidB)是于1982 年由 Kubota等［39］完成的，之后相繼有新的三萜類化合物自靈芝孢子分離得到［6，40］，目前各種靈芝中分離到的三萜類化合物已達(dá)100多種。Tothjo等［41］首次報道了靈芝三萜類化合物的藥理活性，利用提取得到的6種有細(xì)胞毒活性的三萜類化合物ganodericacid U、V、W、X、Y 和 Z進(jìn)行體外實驗，結(jié)果表明三萜類化合物能明顯抑制小鼠肝肉瘤(HTC)細(xì)胞的增殖。Lin等［42］分離到靈芝醛A和雙氫靈芝醛A，體外實驗表明兩者有較強(qiáng)的抑瘤活性，對人肝肉瘤細(xì)胞和KB細(xì)胞ED50值均在1～11 μg/ml，并且以靈芝醛A作用最強(qiáng)。Kimura等［43］的研究表明三萜成份ganoderic acid F在100～200 mg/kg能抑制脾臟的實體瘤生長，并且能明顯抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移;當(dāng)三萜成份達(dá)到800 μg/ml，可抑制腫瘤血管生成。靈芝酸可以通過阻斷人肝瘤細(xì)胞株BEL7402細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)變，使細(xì)胞周期停滯從而抑制癌細(xì)胞的生長，在濃度 500 μg/ml時，其抑制率可以達(dá)到70%［44］。靈芝三萜可以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞G0-G1期停滯，蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示它可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)14的可調(diào)節(jié)型表達(dá)，蛋白質(zhì)14對細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期、凋亡和氧化應(yīng)激起著重要的作用［45］。靈芝三萜對多種腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移都有抑制作用。自南方靈芝(Ganoderma australe)分離出的 applanoxidic acid A、C、F和G可以抑制人早幼粒白血病細(xì)胞系(HL-60 cell line)的生長與增殖［46］。

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