周紀(jì)東，李余動(dòng)

（1.浙江育英職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系， 杭州 310018；2.浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 杭州 310035）

黃花菜屬百合科萱草屬多年生草本植物，又名金針菜，其花可食用，為我國(guó)特產(chǎn)蔬菜。是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、具有多種保健功能的花卉珍品蔬菜，還是一味良藥，其花、葉、根曬干后均可入藥用。[1]《本草綱目》中稱其有安神醒腦、增智寬胸、美容養(yǎng)血、解熱消毒、除煩通乳之功效。[2]黃花菜富含多糖類物質(zhì)。[3]大量研究表明，植物多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗肥胖、控制血糖、降膽固醇、降血脂等多種功能，由于其來源廣泛且沒有細(xì)胞毒性、應(yīng)用于生物體時(shí)毒副作用小等特點(diǎn)而被越來越多的人所關(guān)注，其相關(guān)研究也日益受到重視。[4-5]

近年來，人們深入研究開發(fā)了黃花菜的栽培技術(shù)，黃花菜的種植面積與產(chǎn)量逐年遞增，采摘過程中作為植株主要部分的黃花菜葉子通常不加利用被廢棄。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)黃花菜中化學(xué)成分及其生物活性的研究已展開，主要集中于黃酮、多酚等化合物，[6-8]有關(guān)黃花菜中多糖的研究報(bào)道很少，尚無關(guān)于黃花菜葉中多糖的研究報(bào)道。本文就黃花菜葉中多糖的提取條件、含量測(cè)定及抗氧化活性等進(jìn)行了研究，以期為深度開發(fā)利用黃花菜這一豐富資源提供科學(xué)依據(jù)。

一、材料與方法

（一）試劑與儀器

黃花菜采自浙江省桐廬縣分水鎮(zhèn)，經(jīng)杭州市植物園盧毅軍高級(jí)工程師鑒定為百合科萱草屬黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni）。

試驗(yàn)中使用的乙醇、石油醚、丙酮、硫酸、苯酚、H2O2、氯仿、正丁醇等主要試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，木瓜蛋白酶為Merck公司產(chǎn)品，小鼠購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

試驗(yàn)使用的主要設(shè)備有：HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；752W紫外—可見分光光度計(jì)（上海朗伯儀器有限公司）；Anke TDL-40B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DZF-6021真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

（二）方法

1.多糖提取

提取工藝流程：黃花菜葉子→預(yù)處理→浸提→過濾→濃縮→醇析沉淀→離心分離→粗制PDL→復(fù)溶→除蛋白→脫色→純化→PDL。

（1）樣品預(yù)處理

黃花菜葉子于60℃干燥至恒重，用粉碎機(jī)磨成粉末，過400目篩備用。取適量黃花菜葉子粉末用濾紙包好，放入索氏提取器，用石油醚60～90℃回流脫脂3 h。將脫脂后的濾紙包風(fēng)干，用80%乙醇85℃回流6 h，以除去樣品中單糖、寡糖等，最后自然風(fēng)干濾渣。

（2）熱水浸提

①工藝參數(shù)的單因素試驗(yàn)。影響粗制PDL提取率的因素很多，選擇提取溫度、提取時(shí)間、液固比、提取次數(shù)作為考察因素，在保持其他因素相同條件下，分別考察上述各因素對(duì)多糖提取率的影響。多糖提取率（m/m）/%=[熱水浸提物干品質(zhì)量（g）/樣品質(zhì)量（g）]×100。

②工藝參數(shù)的正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定正交試驗(yàn)的因素水平，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以多糖提取率為考察指標(biāo)，研究粗制PDL浸提工藝參數(shù)的最佳組合。

③濃縮。熱水浸提液用3層紗布過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至約100 mL。

④醇析。向濃縮液中緩慢加入4倍體積的無水乙醇，用玻璃棒緩慢攪拌，使乙醇濃度達(dá)到80%（V/V），4℃靜置24 h，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀即為粗制PDL。

⑤除蛋白與脫色。將粗制PDL復(fù)溶于水，采用中性酶-Sevag法[9]除去蛋白質(zhì)和H2O2氧化法[10]脫色。

⑥純化。將多糖水溶液透析36 h后減壓濃縮，按照④中所述，再次醇析沉淀、離心，所得沉淀分別用95%乙醇、無水乙醇、丙酮各洗3次，60℃真空干燥得PDL。

2.多糖含量測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線建立采用苯酚—硫酸法，[11]所得回歸方程為 A=0.0087ρ（r=0.9997，n=6），式中 A為吸光度，ρ為葡萄糖溶液質(zhì)量濃度(μg/mL)。該標(biāo)準(zhǔn)曲線在葡萄糖溶液質(zhì)量濃度5.00~80.00 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

（2）換算因素的計(jì)算

準(zhǔn)確稱取3份各20 mg PDL，分別用蒸餾水溶解，定容到100 mL。準(zhǔn)確移取0.3 mL按照2（1）的方法測(cè)定吸光值，由回歸方程計(jì)算供試液中葡萄糖質(zhì)量濃度，根據(jù)f=m/（ρ×d）計(jì)算換算因素。式中f為換算因素；m為PDL質(zhì)量(μg)；ρ為PDL供試液中葡萄糖質(zhì)量濃度（μg/mL）；d為多糖的稀釋因素。計(jì)算求得PDL相對(duì)于葡萄糖的換算因素f=1.4972（RSD=1.30%，n=3）。

（3）樣品中多糖含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取6份各10 g黃花菜葉子，按照上述中多糖提取工藝（優(yōu)化后）分別制備出粗制PDL和PDL各3份，分別用蒸餾水溶解，定容到500 mL，稀釋100倍后準(zhǔn)確移取1 mL按照上述方法測(cè)定吸光值，由回歸方程計(jì)算供試液中葡萄糖質(zhì)量濃度，根據(jù)w=[（ρ×d×f）/m]×100計(jì)算黃花菜葉中多糖含量，式中w為多糖含量 (%,m/m)；ρ為供試液中葡萄糖質(zhì)量濃度(μg/mL)；d為樣液的稀釋因素；f為換算因素；m 為樣品質(zhì)量（μg）。

3.PDL供試液的配制

準(zhǔn)確稱取200 mg PDL，溶于100 mL蒸餾水配制成2 mg/mL PDL供試液。

4.PDL清除羥自由基（·OH）能力的測(cè)定

反應(yīng)體系中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各1mL及0.1～0.5 mL PDL供試液（空白對(duì)照組加入蒸餾水），加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)30 min，以蒸餾水做參比溶液，在510 nm處測(cè)吸光度。[12]清除率計(jì)算公式為S(%)=[（A0-Ai）/A0]×100，式中A0為空白對(duì)照液吸光度，Ai為供試液吸光度。

5.PDL清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力的測(cè)定

反應(yīng)體系中加入0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.2）緩沖液4.5 mL，再加入0.1～0.5 mL PDL供試液（空白對(duì)照組加入蒸餾水），用蒸餾水定容至8 mL，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)10 min，加入預(yù)熱至25℃的6 mmol/L鄰苯三酚溶液0.1 mL，計(jì)時(shí)搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)3 min后，加入8 mol/L HCl溶液0.5 mL終止反應(yīng)，以蒸餾水做參比溶液，在325 nm處測(cè)定吸光度。[13]清除率計(jì)算公式同上。

6.PDL抑制LPO能力的測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[14]制備10%（V/V）肝組織勻漿。反應(yīng)體系中加入1 mL生理鹽水、1 mL肝組織勻漿，再加入0.1～0.5 mL PDL供試液（空白對(duì)照組加入蒸餾水）、80%（V/V）CCl4-酒精溶液0.5 mL，混勻后置于37℃水浴中反應(yīng)40 min，立即加入100 g/L三氯醋酸溶液1 mL混勻，3 500 r/min離心10 min。取上清液2 mL，加入5 g/L硫代巴比妥酸（TBA）顯色劑2 mL，混勻后于沸水浴中煮沸15 min，冰浴中速冷至室溫后，以蒸餾水做參比溶液，在535 nm處測(cè)定吸光度。[14]抑制率計(jì)算公式同上。

二、結(jié)果與分析

（一）單因素試驗(yàn)結(jié)果

1.液固比對(duì)PDL提取率的影響

采用70℃熱水浸提2 h，改變液固比，考察不同液固比對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果見圖1。

如圖1所示，隨著液固比增加，多糖提取率不斷增大，直至液固比達(dá)到35∶1后，不再增大并趨于回落。鑒于后續(xù)的濃縮工藝，所以選擇液固比為35∶1為宜。

圖1 液固比對(duì)多糖提取率的影響

2.浸提時(shí)間對(duì)PDL提取率的影響

采用浸提溫度70℃，液固比35∶1，改變浸提時(shí)間，考察不同浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

如圖2所示，當(dāng)浸提時(shí)間在2~4 h時(shí)，多糖提取率緩慢增大，4 h后回落并趨于穩(wěn)定。為了縮短工時(shí)，減少能耗，浸提時(shí)間以選擇3 h為宜。

3.浸提溫度對(duì)PDL提取率的影響

采用液固比35∶1，改變浸提溫度，熱水浸提3h，考察不同浸提溫度對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 浸提溫度對(duì)多糖提取率的影響

圖3所示，隨著浸提溫度升高，多糖提取率不斷增大，90℃時(shí)達(dá)到最大值，溫度繼續(xù)升高反而顯著下降。由此推測(cè)，高溫對(duì)PDL的結(jié)構(gòu)與活性有一定影響，所以90℃是多糖浸提的合適溫度。

4.浸提次數(shù)對(duì)PDL提取率的影響

采用浸提溫度90℃，液固比35∶1，浸提時(shí)間3h，改變浸提次數(shù)，考察不同浸提次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 浸提次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

圖4所示，第1次浸提到的多糖最多，隨著次數(shù)的增加，每次浸提到的多糖質(zhì)量越來越少，至第4次浸提到的多糖總質(zhì)量反而有所下降。由此推測(cè)，持續(xù)高溫下浸提可能會(huì)造成PDL降解。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，浸提次數(shù)應(yīng)不超過3次。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

（二）正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定因素水平見表1。正交試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

由表2可知，根據(jù)極差R值分析結(jié)果，4個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響次序?yàn)樘崛〈螖?shù)(D)＞提取溫度（C）＞提取時(shí)間（B）＞液固比（A）。PDL浸提工藝參數(shù)的最佳組合為A1B2C2D3，即提取溫度90℃，提取時(shí)間3 h，液固比30:1，提取3次。按照此最佳組合條件進(jìn)行浸提工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示多糖提取率為 9.13%（RSD=2.45%，n=3）。

（三）樣品中多糖含量測(cè)定

上述所得粗制PDL和PDL的供試液分別測(cè)得吸光值，代入公式計(jì)算得粗制PDL和PDL的多糖含 量 分 別 為 10.49%（RSD=2.77% ，n=3）、6.05%（RSD=3.30%，n=3）。由此表明，粗制PDL在經(jīng)過除蛋白、脫色等純化工藝過程中，其多糖含量有所損失。

（四）PDL對(duì)羥自由基（·OH）的清除效果

Fenton反應(yīng)體系中H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，加入水楊酸捕捉·OH生成有色物質(zhì)。PDL可抑制H2O2引發(fā)·OH生成，通過測(cè)定有色物質(zhì)的積累量，可表征PDL對(duì)·OH的清除效果。如圖5所示，PDL質(zhì)量與·OH的清除率存在正相關(guān)，但其最大清除率僅為19.45%，清除效果偏低。

圖5 PDL對(duì)·OH的清除效果

（五）PDL對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除效果

鄰苯三酚在堿性條件下自氧化釋放O2-·，并生成帶色中間產(chǎn)物。PDL可抑制鄰苯三酚自氧化生成O2-·，通過測(cè)定帶色中間產(chǎn)物的積累量，可表征PDL對(duì)O2-·的清除效果。圖6所示，PDL對(duì)O2-·具有一定的清除效果，并呈量效效應(yīng)。PDL對(duì)O2-·的最大清除率達(dá)到55.31%，清除效果較為明顯。

圖6 PDL對(duì)O2-·的清除效果

（六）PDL對(duì)LPO的抑制效果

在CCl4-酒精溶液誘導(dǎo)下，小鼠肝組織中脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)產(chǎn)生過氧化物丙二醛，可與顯色劑反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。丙二醛生成量可表征脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度。PDL可抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成丙二醛，通過測(cè)定有色產(chǎn)物的積累量，可表征PDL對(duì)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制效果。結(jié)果見圖7。圖7所示，PDL可抑制丙二醛的生成，表明PDL可抑制CCl4-酒精溶液所誘導(dǎo)的肝組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，且呈量效效應(yīng)。PDL對(duì)LPO的最大抑制率為42.17%，抑制效果較為明顯。

圖7 PDL對(duì)LPO的抑制效果

綜上，PDL對(duì)3種自由基的最大清除效果比較可知，O2-·（55.31%）＞LPO（42.17%）＞·OH（19.45%），均未超過60%。由此推斷，PDL對(duì)自由基的清除效果不顯著。

三、結(jié) 論

PDL浸提工藝參數(shù)為提取溫度90℃，提取時(shí)間3 h，液固比30∶1，提取3次。按此浸提，多糖提取率為9.13%，多糖含量為6.05%。

PDL對(duì)3種自由基的清除效果不顯著，且黃花菜葉中PDL含量較低，表明葉子作為光合作用的營(yíng)養(yǎng)器官，其中的多糖大都是貯存性多糖，抗氧化活性不強(qiáng)。

關(guān)于黃花菜其它器官如花和根中多糖的含量及生物活性的研究有待于開展，其結(jié)果可與本研究進(jìn)行比較與探討。

[1]張西露，粟建文，葉英林.祁東縣黃花菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對(duì)策分析[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（15）：148-151.

[2]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[Z].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：1947-1948.

[3]韓志平，張春業(yè)，張海，等.黃花菜和3種食用菌營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究[J].山西大同大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2013（5）：63-65.

[4]葉濤，葉湘漓，賀建華.植物多糖功能與作用機(jī)理的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2012（1）：22-23.

[5]周靜華，左紹遠(yuǎn).植物多糖生物學(xué)活性研究進(jìn)展[J].大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2012（6）：35-37.

[6]周秀梅，王秀蘭，沈楠.黃花菜粗黃酮提取工藝優(yōu)化[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2013（15）：59-62.

[7]白雪松，杜鵑，劉新迪.黃花菜根中總黃酮的超聲提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（12）：7108-7109.

[8]周向軍，高義霞，張繼.黃花菜多酚提取工藝及抗氧化作用的研究[J].作物雜志，2012（1）：68-72.

[9]胡喜蘭，許瑞波，陳宇.牛蒡葉多糖的提取及生物活性研究[J].食品科學(xué)，2013（2）：78-82.

[10]王辰龍，張子奇，王曼，等.黑木耳多糖的提取分離及體外抗凝血作用研究[J].食品工業(yè)科技，2013（9）：238-241.

[11]張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].杭州：浙江大學(xué)出版社，2006：11-12.

[12]劉航，國(guó)旭丹，馬雨潔，等.超聲波輔助提取苦蕎麥多糖工藝優(yōu)化及其體外抗氧化研究[J].食品科學(xué)，2013（14）：45-50.

[13]邵平，劉佳，王歐麗，等.銅藻多糖微波輔提工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2014（6）：1062-1069.

[14]黃朋納，黃清松.海藻多糖抗氧化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].宜春學(xué)院學(xué)報(bào)，2012（4）：106-108.