王林果，康　娟

（普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽，471000）

藥物不敏感的原因分析及解決措施

王林果，康娟

（普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽，471000）

獸醫(yī)臨床常用的藥敏試驗方法主要有兩種，即擴(kuò)散法和稀釋法。擴(kuò)散法屬手工測試方法，通過測試藥物紙片或者牛津杯在固體培養(yǎng)基上的抑菌圈的大小，判斷細(xì)菌對該種藥物是否敏感。稀釋法包括試管稀釋法和微量稀釋法，通過測試細(xì)菌在含不同濃度藥物培養(yǎng)基內(nèi)的生長情況，判斷其最低抑菌濃度（MIC）。由于擴(kuò)散法操作簡單，成本低，已經(jīng)被大多數(shù)獸醫(yī)臨床實驗室和基層單位所采用。擴(kuò)散法又包括紙片法、牛津杯法和打孔法，目前獸醫(yī)臨床應(yīng)用較多的方法是紙片法，以下針對該法進(jìn)行分析。

按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行操作，測量出抑菌圈大小，根據(jù)藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，獲得比較敏感的藥物，現(xiàn)場使用常常出現(xiàn)敏感藥物得不到良好的治療效果，或者藥敏試驗不敏感的藥物在現(xiàn)場使用卻能獲得較好的治療效果，這是很多從事獸醫(yī)實驗室工作的獸醫(yī)想不明白的，是不是藥敏試驗做錯了？還是藥物是假藥？又或者是藥敏試驗本身就不靠譜？一堆的問號讓獸醫(yī)工作者無所適從，那么究竟為何會有這樣的結(jié)果，有了這樣的結(jié)果該如何改善？筆者結(jié)合工作經(jīng)驗，分析總結(jié)了藥物不敏感的原因及解決措施，以供讀者參考。

1　藥敏試驗步驟（紙片法）

無菌采集合適的病料組織，無菌接種培養(yǎng)皿或者肉湯，再置于37℃溫箱中培養(yǎng)16～24h增菌；在超凈工作臺中或酒精燈旁，用無菌棉簽或經(jīng)酒精燈火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方式將菌液均勻涂布到平皿中的固體培養(yǎng)基表面。

用無菌鑷子將紙片（提前制備好）放于固體培養(yǎng)基表面并輕壓，使紙片與培養(yǎng)基表面完全接觸。為了能準(zhǔn)確觀察結(jié)果，要求藥敏紙片均勻分布于培養(yǎng)基上，位置安排適中，防止出現(xiàn)抑制圈重疊。一般各紙片中心相距應(yīng)大于24 mm，可在平皿中央貼一片，外周等距離貼5～6片。標(biāo)記每種藥敏紙片的名稱。貼完紙片的平皿15 min后再置于37℃溫箱中培養(yǎng)16～24 h，觀察記錄結(jié)果。

結(jié)果判讀：以藥敏紙片周圍沒有肉眼可見生長物區(qū)域為抑菌圈，根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷細(xì)菌對抗菌藥的敏感性。

2　影響藥敏試驗結(jié)果的因素

2.1試驗本身因素

培養(yǎng)基：①培養(yǎng)基成分的不同，不僅影響敏感菌株的生長繁殖，還可影響到抑制圈的直徑。一般細(xì)菌，如大腸桿菌及葡萄球菌可使用普通營養(yǎng)瓊脂；做磺胺類藥物敏感試驗時應(yīng)選用無蛋白胨平板；鏈球菌和巴氏桿菌可用綿羊血瓊脂平板。②傾注平板時，厚度應(yīng)合適（約5～6 mm），不可太薄，一般90 mm直徑的培養(yǎng)皿，傾注培養(yǎng)基18～20 ml為宜。③培養(yǎng)基內(nèi)應(yīng)盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質(zhì)，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。④市場提供的藥敏試驗的培養(yǎng)基缺乏嚴(yán)格質(zhì)控，質(zhì)量難以保證，建議采購質(zhì)量過硬的產(chǎn)品或者自制培養(yǎng)基。

細(xì)菌接種量：細(xì)菌接種量應(yīng)恒定，如接種量太多，抑菌圈變小，能產(chǎn)酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。

藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結(jié)果，需精確配制。商品藥應(yīng)嚴(yán)格按照其推薦治療量配制。市場售賣的藥敏紙片缺乏嚴(yán)格質(zhì)控，質(zhì)量難以保證，建議按要求自制藥敏紙片。

培養(yǎng)時間：一般細(xì)菌培養(yǎng)溫度和時間為37℃，12～24 h，有些抗菌藥擴(kuò)散慢，如多粘菌素，可將已放好藥敏紙片的培養(yǎng)基先置4℃冰箱內(nèi)2～4 h，使抗菌藥預(yù)擴(kuò)散，然后再放37℃溫箱中培養(yǎng)，可以推遲細(xì)菌的生長，而得到較明顯的抑菌圈。

2.2獸醫(yī)人員的因素

操作的問題：①標(biāo)準(zhǔn)的藥敏試驗需要先進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，故藥敏試驗報告出結(jié)果時間長，檢驗與臨床缺乏溝通，對于基層獸醫(yī)站或養(yǎng)殖場，藥敏結(jié)果不能滿足臨床治療要求，容易延誤治療時機(jī)。目前常規(guī)基層獸醫(yī)實驗室都采用自創(chuàng)的簡便方法（無菌取病死畜禽的部分肝、脾等組織，按1：5加生理鹽水研磨制成懸液，靜置5 min，用無菌吸管吸懸液，加兩滴于營養(yǎng)瓊脂板上，涂布均勻，5 min后貼上藥敏試紙，培養(yǎng)、觀察抑菌圈大?。?，這個方法可以快速獲得結(jié)果，但結(jié)果往往也出現(xiàn)誤差，原因如下：一是細(xì)菌量較少，二是污染的問題很難排除，結(jié)果不一定是臨床細(xì)菌所致；②自制藥敏片無法保證每一片紙片所含藥物有效成分均一，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)誤差，建議采用牛津杯法進(jìn)行實驗，用精密的移液槍可以量化每個牛津杯中的藥物含量。

對每種藥物的藥動學(xué)一知半解：在選擇高敏藥物時沒有考慮藥物的吸收途徑。藥敏試驗是藥液直接和細(xì)菌接觸，而在給畜禽用藥時，必須通過機(jī)體的吸收才能使藥物發(fā)揮療效，故在給畜禽用藥時，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，并予以足夠劑量、足夠療程，才會取得好的治療效果。例如，新霉素腸道吸收較差，可以引起高濃度的腸道藥物濃度，治療腸道疾病是非常好的藥物。

誤診、濫用藥物導(dǎo)致病菌耐藥性：絕大多數(shù)養(yǎng)殖者或技術(shù)人員是在沒有明確微生物學(xué)診斷的情況下使用抗菌藥物，養(yǎng)殖場規(guī)模越小，細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗做得越少。最常見的是大多數(shù)養(yǎng)殖場輪番使用多種抗菌藥物而不做細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗，致使療效不佳，治療時機(jī)延誤和藥品的浪費(fèi)。一些病例用藥前不做藥敏試驗，而是在大量使用多種抗菌藥物療效不明顯時才想起做細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗，而此時細(xì)菌已對多種抗菌藥產(chǎn)生耐藥性。

不了解致病菌特性：臨床上存在一些營養(yǎng)需求較高的細(xì)菌或微生物，如鏈球菌和支原體，臨床上較難培養(yǎng)，這些疾病不能使用藥敏試驗獲得結(jié)果，往往分離到的一些無關(guān)細(xì)菌導(dǎo)致藥敏試驗失敗。

沒有真正理解藥敏試驗：方法不統(tǒng)一，沒有標(biāo)準(zhǔn)化，隨意改動藥敏試驗步驟，隨意改動藥物濃度，隨意改動培養(yǎng)時間等。

3　解決措施

那么如何才能獲得與藥敏試驗一致的治療效果呢？正確的藥敏試驗可獲得敏感性較高、價廉、易得、安全的藥物進(jìn)行治療，同時減少耐藥菌株產(chǎn)生，具體措施如下。

正確理解抑菌圈數(shù)值：藥敏試驗結(jié)果僅為臨床選擇高敏藥物的參考。受動物機(jī)體及環(huán)境等因素影響，藥物的藥敏試驗與臨床治療效果的符合率一般為70%～80%，所以也不能過分地依賴藥敏試驗，如發(fā)現(xiàn)療效不顯著應(yīng)及時換藥。

定期監(jiān)控本場細(xì)菌耐藥性情況：藥敏試驗確定的首選藥物不是一成不變。隨著藥物使用頻率的增加及新特藥的不斷出現(xiàn)，細(xì)菌對原先的高敏感藥物可能不再敏感。因此，定期進(jìn)行藥敏試驗了解本場細(xì)菌對抗菌藥的敏感性情況是很有必要的。

藥敏試驗藥物選擇原則：避開已經(jīng)使用過的藥物或其同類藥物，發(fā)病期間已用過的藥物或同類藥物一般不用。

臨床選藥要慎重：①窄譜抗生素能解決的問題不選廣譜抗生素，一種抗生素可達(dá)到治療作用時，不要輕易用兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用。②必須應(yīng)用兩種抗生素時，應(yīng)選擇聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用的藥物。③在選擇高敏藥物時要考慮藥物的吸收途徑及其藥動學(xué)，有的放矢。

開展聯(lián)合藥敏試驗：①病因不明而又危及生命的嚴(yán)重感染；②單一抗菌藥不能有效控制的混合感染及嚴(yán)重感染；③長期治療、細(xì)菌易產(chǎn)生耐藥性的慢性感染；④一般抗菌藥不易透入病灶的感染；⑤毒性較大，聯(lián)合用藥減少劑量后可降低毒副反應(yīng)的抗菌藥。臨床上出現(xiàn)以上情況需要聯(lián)合用藥，這種情況下必須進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗。

總之，獸醫(yī)臨床中紙片法藥敏試驗結(jié)果受到多種因素的影響，在沒有標(biāo)準(zhǔn)和嚴(yán)格操作規(guī)程的情況下，抑菌圈的大小體現(xiàn)出一個細(xì)菌對藥物體外的敏感度的高低，也就是說這種藥物抑菌圈的有無或大小只能判斷出該藥對細(xì)菌有沒有效果，敏感性的高低只能通過科學(xué)、嚴(yán)格的實驗來確定?！?/p>

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2015-01-25）