白濟豪

(哈爾濱市動物衛(wèi)生防疫站，黑龍江 哈爾濱150016)

1 稀釋液與冷凍保護劑

近30年來人們研制了各種豬的凍精稀釋液。一般來說，各種稀釋液都含有糖、蛋白和脂蛋白、緩沖液、添加劑及冷凍保護劑。根據(jù)其成分可以分為兩大類: 第一類是不含緩沖液的稀釋液，例如卵黃 葡萄糖、卵黃 乳糖、卵黃 蔗糖-EDTA-Mg-Ca 溶液; 第二類為含緩沖液的稀釋液，例如氨基乙酸 磷酸鹽和葡萄糖 磷酸鹽、卵黃 葡萄糖 檸檬酸、Beltsville F3 (BF3) 、Beltsvle F5(BF5) 、Tes- tris 果糖 檸檬酸 卵黃(TEST) 、Tes- NaK 果糖 卵黃、Tris 果糖 EDTA 卵黃、Tris 果糖 EDTA 卵黃等。

如果進行兩步稀釋時，含甘油的稀釋液可在將精液降溫到5℃時加入。

稀釋液的成分雖然差別很大，但其共有的特點是甘油濃度低，平衡時間短。甘油與精子接觸時間的長短對精子經受冷凍解凍的能力沒有明顯影響。目前，大多是在冷凍前任何時間均可加入甘油，加入后甘油能很快被吸收而進入精子。

雖然人們對許多冷凍保護劑的效果進行了研究，但對豬的精子而言仍以甘油的效果最好。其他效果較好的保護劑還有木糖醇、核糖醇、乙酰胺和DMSO，這些物質在濃度較低時能提高精子解凍后的活力，但頂體完整的精子數(shù)減少。因此，目前甘油仍是豬冷凍精液最常用的冷凍保護劑。只是豬精子對甘油最為敏感，其在冷凍保存豬精子時的最佳濃度受許多因素的影響，例如冷凍速度等。一般情況下，甘油的濃度均較低，如果濃度過高，雖然能有效保護精子，但精子的受精能力會降低，也會損傷頂體膜，改變膜的通透性。

2 降溫速度及其與甘油濃度的關系

目前冷凍豬精液的方法基本有兩種，即Beltsville 法和Westendorf 法。前者是將富含精子的部分采集后與精清持留2 h，然后離心，降溫3 h后在干冰上制成0.15 ～0.20 mL 的顆粒凍精。后一種方法是將精液按1∶2 稀釋，然后在Hulsenberg 8稀釋液中降溫，最后制備成細管凍精。后來，人們根據(jù)研究結果對細管凍精進行了改進，如2 mL 的細管凍精、5 mL 的塑料袋等劑型，但在生產中仍未能廣泛普及。

甘油的冷凍保護效果受許多因素的影響。其一是降溫速度。當含精子的懸浮液降溫到溶液的冰點以下時，精子和溶劑會出現(xiàn)超冷，最后形成冰晶，當膜系統(tǒng)阻止冰晶膨脹時精子內容物并未冷凍。隨著溫度的降低，超冷的細胞水分對增加的滲透壓發(fā)生反應，擴散出細胞而結凍。外滲的速度受細胞膜通透性的影響，特別是膜對水分和甘油通透性的影響，也受細胞大小和細胞表面積比例的影響。這種影響在一定程度上可以通過調節(jié)冷凍速度和冷凍保護劑濃度得到改善，如果冷凍速度很慢，則精子通過脫水而避免了細胞內結冰。如果精子冷凍過快，則細胞內的水分因不能外滲而結冰。根據(jù)這種雙因素理論，精子細胞受損主要來自兩個方面: 其一是由于冷凍速度不適宜而引起脫水，這稱為溶液效應，主要是由于細胞與高濃度的溶劑發(fā)生反應，因此pH 發(fā)生變化; 其二是由于精子冷凍過快而引起細胞內結冰。

對甘油濃度和冷凍速度對精子活力的影響進行的研究表明，如果降低甘油濃度則應加速冷凍速度。就精子活力而言，最佳甘油濃度為3% ～4%，對最佳的頂體完整性(NAR) 而言，最佳濃度為0 ～1%。對這兩個參數(shù)而言，最佳的冷凍速度為30℃/min。據(jù)此有人建議，冷凍豬精子時甘油濃度為3%，冷凍速度為30℃/min。甘油濃度超過6%時會明顯引起頂體損傷，這種作用可能是由于化學毒性或滲透壓變化所引起。

快速冷凍過程中精子質膜脂類的組成及組織也會發(fā)生明顯的改變，可使膜的通透性增加。許多研究表明，冷凍解凍的精子會出現(xiàn)類似于獲能的變化，精子通過流式細胞儀篩選時也會出現(xiàn)這些變化。

3 解凍

通過關鍵溫區(qū)解凍精子的速度是影響精子存活的另一個極為重要的因素。盡管制成細管凍精的越來越多，但豬的精液大多數(shù)是在干冰上制成顆粒凍精。顆粒凍精一般在預熱的溶液中解凍時由于加熱速度快，因此效果較好。解凍效果與冷凍速度有密切關系，對精子的存活有顯著的影響。如果冷凍速度適宜，則隨著解凍速度的加快，精子活力和頂體完整率增加。快速解凍顆粒凍精時效果也很好，說明精子快速冷凍后的冷凍損傷主要是由于慢速解凍時小冰晶向外生長所引起。解凍速度對頂體完整率的影響也受甘油濃度的影響，濃度高時對頂體的完整性影響更大。目前的研究表明，要獲得最高的活力和頂體完整率，豬精液冷凍稀釋液的甘油濃度應為3%，在0℃ ～- 50℃時的冷凍速度應該為30℃/min，解凍速度為1 200℃/min。

快速解凍時的最終溫度對精子的存活也有明顯影響，如果豬的精子在5 ～37℃快速解凍，會損傷頂體質膜，但不會引起酶的外瀉及降低精子活力，這種所謂的“熱休克”也受溫度范圍的影響。

4 冷凍精液的輸精效果

20 世紀70年代以前大多采用手術方法將精液輸入到輸卵管，因此效果較差。1971年才通過子宮頸輸入凍精獲得產仔。目前的研究表明，冷凍精液的產仔率可達到50%，每窩可產7 仔。荷蘭對顆粒凍精一次輸精和鮮精一次輸精效果進行比較，其產仔率和窩產仔數(shù)分別為47%、7.4 和79%、10.6，而且結果在品種間還有明顯差別。研究結果顯示，顆粒凍精和細管凍精的產仔率和窩產仔數(shù)分別為55%、8.3 和58%、9.0。目前在采用凍精輸精時，第1 次是在檢查到發(fā)情后30 h，第2 次是在10 ～12 h 之后。