蔡恬靜 劉青杰

·綜述·

放射生物劑量學(xué)研究的新進(jìn)展

蔡恬靜 劉青杰

放射生物劑量學(xué)方法在歷次放射事故應(yīng)急處置中起到非常重要的作用，主要采用非穩(wěn)定性染色體畸變和微核分析。最近的研究關(guān)注快速高通量的生物劑量計的探索，不僅涉及上述方法的自動化，還涉及DNA雙鏈斷裂、基因表達(dá)等分子生物學(xué)劑量計的研究以及代謝組學(xué)和血清學(xué)指標(biāo)的篩選。筆者主要就2012-2014年放射生物劑量學(xué)研究的新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

放射生物劑量學(xué)；細(xì)胞遺傳學(xué)；快速高通量分析；分子生物學(xué)

放射生物劑量計最開始主要用于涉及少數(shù)受照人員的事故劑量估算[1]。在前蘇聯(lián)發(fā)生切爾諾貝利核事故后，放射醫(yī)學(xué)界開始關(guān)注大人群受照情況下的生物劑量估算。美國和歐盟都已投入了大量經(jīng)費支持放射生物劑量學(xué)新指標(biāo)的探索。2011年日本福島特大核事故發(fā)生后，快速、高通量的放射生物劑量學(xué)新指標(biāo)引起了更廣泛關(guān)注。我國放射生物劑量學(xué)專家也在放射生物劑量學(xué)方面做了大量的工作，出版了相關(guān)專著[2-3]。本文主要就2012-2014年放射生物劑量學(xué)研究的新進(jìn)展作一簡要綜述，希望起到拋磚引玉的作用，促進(jìn)國內(nèi)放射生物劑量學(xué)研究的發(fā)展。

1 細(xì)胞遺傳學(xué)劑量指標(biāo)的新進(jìn)展

經(jīng)典的非穩(wěn)定性染色體畸變[如雙著絲粒（dicentrics，dic）]、微核（以下所述均為用松胞素B制備的微核，cytokinesisblockmicronucleus，CBMN）制備技術(shù)已經(jīng)成熟，目前的研究主要涉及這些指標(biāo)分析的自動化。同時，早熟染色體凝聚（premature chromosome condensation，PCC）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、定向基因組雜交（directional genomic hybridization，DGH）[4-5]和細(xì)胞組學(xué)等的發(fā)展，使細(xì)胞遺傳學(xué)生物劑量指標(biāo)更趨完善。

1.1 dic和CBMN的自動化分析

關(guān)于受照人員劑量估算最常用的dic和CBMN兩項生物劑量計的自動化分析研究，多與生物劑量網(wǎng)絡(luò)研究合并進(jìn)行分析。國內(nèi)關(guān)于染色體畸變和微核的自動化分析研究較少，主要原因是具備這兩方面知識背景的人員奇缺，而且一般需要細(xì)胞遺傳學(xué)家和圖像自動識別專家的合作來完成。

關(guān)于dic的自動化分析，世界各國首先建立自己的圖像分析軟件進(jìn)行探索性研究，對吉姆薩染色的染色體標(biāo)本的自動化分析速度、所需最少的細(xì)胞數(shù)等方面進(jìn)行探索。如加拿大用原創(chuàng)性分析軟件分析dic，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分析1025個標(biāo)本時，每例分析200個中期分裂相僅用時1.4 h，大大提高了分析效率[6]。法國的研究探索了均勻照射和局部照射所需分析的細(xì)胞數(shù)，考慮到不確定性和分析時間，均勻照射情況下，建議自動化分析至少應(yīng)分析1000個中期分裂相。最后確定劑量時應(yīng)根據(jù)初始估算劑量確定應(yīng)分析分裂相數(shù)：大于1 Gy時建議為1500個中期分裂相；初始估算劑量低于1 Gy或懷疑局部受照情況，應(yīng)分析3000個中期分裂相[7]。隨著自動化技術(shù)的發(fā)展，用熒光染色的中期分裂相更適合自動化分析。Beaton等[8]用碘化丙啶和著絲粒標(biāo)記后，用EMD-Millipore公司的ImageStreamX軟件在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行染色體畸變的分析，結(jié)果證實了該方法的可靠性。目前染色體畸變的自動化分析多采用熒光染色的標(biāo)本。

為了適應(yīng)快速高通量的分析要求，有研究者提出用人工分析染色體畸變來對受照的大人群進(jìn)行快速分類的解決辦法，一是可以減少每位受照者的分析細(xì)胞數(shù)，如以dic為觀察終點，分析20～50個中期分裂相就可以給出大致分類；二是建立實驗室網(wǎng)絡(luò)以相互支持，發(fā)生核與輻射事件情況下可快速分析足夠的中期分裂相來快速估算受照劑量。目前dic自動化分析研究集中在自動化分析或半自動化分析與人工分析的比較。De Amicis等[9]研究認(rèn)為，分析dic時，每例自動化分析20～500個中期分裂相足夠進(jìn)行分類。在歐盟FP97多種生物劑量（MULTIBIODOSE EU FP97）項目中，組織6個實驗室進(jìn)行半自動化分析和人工分析對比，在半自動化分析中，判定人員分析核對150個分裂相平均用時2 min，而全人工分析50個分裂相需要60 min[10]。進(jìn)一步組織8個實驗室驗證網(wǎng)絡(luò)云盤照片庫的作用[11]。由其中4個實驗室將拍攝的2300個高分辨中期分裂相圖片保存在云盤照片庫中。這些圖片分3種情況：急性照射、局部照射和遷延照射，劑量均為0～5.0 Gy。拍攝照片的4個實驗室中，2個實驗室采用秋水仙素作用3 h、染色用熒光吉姆薩法，另外2個實驗室采用秋水仙素作用24 h、染色用常規(guī)吉姆薩染色。參與分析的8個實驗室，每個實驗室分析3個已知劑量點照射后的中期分裂相（100個細(xì)胞/劑量點）用于劑量效應(yīng)曲線的建立，另外分析3個未知劑量照射后的中期分裂相（50個細(xì)胞/劑量點）。開始先用快速瀏覽模式分析（不仔細(xì)確定每條染色體是否存在），然后再進(jìn)行常規(guī)分析（確定46條染色體是否都存在），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線非常類似，線性平方方程的參數(shù)無顯著性差異。實驗室之間、制備和染色方法、秋水仙素作用時間均未影響結(jié)果。因此認(rèn)為，基于網(wǎng)絡(luò)的dic分析是高通量的生物劑量策略，適于大規(guī)模輻射事故情況下的劑量估算。最近的一項研究進(jìn)一步證明，依靠網(wǎng)絡(luò)可以最大限度地利用全世界的力量很快獲得準(zhǔn)確的劑量估算[12]。模擬一名人員受到60Co全身急性照射，該人員未佩戴個人劑量計、2～3 h開始嘔吐并出現(xiàn)其他臨床癥狀。來自南美洲、北美洲、歐洲和亞洲的6個實驗室參加演練，在不知道受照劑量的情況下，被要求分析超過800個中期分裂相電子圖片中的dic，并估算受照劑量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，估算的平均劑量為1.89 Gy，而實際受照劑量為2 Gy，在允許誤差范圍內(nèi)。

未來的dic分析平臺包括適于運輸?shù)难翰杉噭┖?、?xì)胞活性分析儀、自動液體分裝儀、中期分裂相自動收獲儀、中期分裂相分散儀、高通量標(biāo)本染色儀和蓋片系統(tǒng)、高通量中期分裂相尋找系統(tǒng)、多個衛(wèi)星重復(fù)序列染色體畸變分析系統(tǒng)和計算機控制的標(biāo)本追蹤系統(tǒng)等。

關(guān)于輻射誘導(dǎo)的CBMN分析，其優(yōu)點是經(jīng)濟(jì)、容易和快速，不足是本底高而且變異大，與性別和年齡有關(guān)，因此大于0.2～0.3 Gy的照射才能被探測到與本底有顯著性差別[13]。最近的發(fā)展包括：①由于本底微核的形成多是與落后的整條染色體有關(guān)，而照射誘發(fā)的微核多是無著絲粒斷片，因此，用泛著絲粒探針的FISH技術(shù)很容易分辨微核是來自本底還是照射誘導(dǎo)[14]；②分析雙核細(xì)胞中的核質(zhì)橋提高輻射特異性；③大樣本的快速自動化分析。不同實驗室使用的CBMN自動化分析軟件有所不同，如MetaSystems Metafer MNScore（image cytometry）systems、ImageStreamX和 Fast image analysis等[15-17]。在Lyulko等[17]的研究中，采集7個人的指尖血，0～10 Gy離體照射，用不同的熒光染色細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，用Fast image analysis軟件（美國快速自動化生物劑量工具 Fast automated Biodosimetry Tool的一部分）分析單核細(xì)胞與雙核細(xì)胞之比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些指標(biāo)均隨劑量增加而增高。自動化分析結(jié)果與手動分析結(jié)果的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.914～0.998。對CBMN的人工和自動化分析比較顯示，自動化分析100～200個雙核細(xì)胞足以進(jìn)行臨床的快速分類[9，18]。

有研究者提出，適用于dic和CBMN快速高通量自動化分析的未來平臺應(yīng)包括用于自動化分析的、放置在架子上的微平板和微試管。快速高通量分析平臺開始于用排列在標(biāo)準(zhǔn)化架子上的微試管取血，結(jié)束于在標(biāo)準(zhǔn)化多孔和多通道平板中進(jìn)行的細(xì)胞遺傳學(xué)分析[19]。

1.2 細(xì)胞組學(xué)指標(biāo)中的核質(zhì)橋

以胞質(zhì)分裂阻滯法為基礎(chǔ)建立的細(xì)胞組學(xué)分析，除了可以分析微核外，還可以分析核質(zhì)橋、核芽、細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡、核分裂指數(shù)等指標(biāo)。其中核質(zhì)橋是近年來研究最多的指標(biāo)之一[21]。其原因有：①核質(zhì)橋形成機制之一認(rèn)為核質(zhì)橋來源于dic，因為dic是輻射特異的生物標(biāo)志物，因而核質(zhì)橋有可能達(dá)到生物劑量計輻射特異的要求；②胞質(zhì)分裂阻滯方法獲得的標(biāo)本可以避免常規(guī)染色體畸變分析因間期細(xì)胞死亡而造成可供分析細(xì)胞數(shù)偏少的問題；③容易實現(xiàn)自動化分析。這些原因使得核質(zhì)橋分析結(jié)合了dic和CBMN的優(yōu)點，因此最先建立CBMN方法的澳大利亞Fenech教授提出，核質(zhì)橋有潛力成為輻射生物劑量計[21]。

筆者所在的實驗室對電離輻射誘發(fā)的人外周血淋巴細(xì)胞核質(zhì)橋進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)核質(zhì)橋不僅在較高劑量范圍（60Co γ射線，0～6 Gy）內(nèi)可以有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系[22]，而且在0～1 Gy、0～0.4 Gy劑量范圍內(nèi)均有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，只是在低劑量范圍內(nèi)分析細(xì)胞數(shù)要相應(yīng)地增加（未發(fā)表的資料）。進(jìn)一步的研究顯示：高傳能線密度射線12C6+誘導(dǎo)的人外周血淋巴細(xì)胞核質(zhì)橋發(fā)生率在0～8 Gy范圍內(nèi)具有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。最新的研究表明，核質(zhì)橋是來源于dic染色體，用泛著絲粒探針的FISH顯示核質(zhì)橋上有兩個著絲粒信號[23]。接下來的研究將對電離輻射誘導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞核質(zhì)橋的影響因素進(jìn)行分析。

1.3 PCC

PCC主要適用于受到大劑量照射人員的劑量估算。目前有關(guān)PCC的研究，一方面是PCC制備方法的發(fā)展和完善，另一方面是探索哪些指標(biāo)可以用于劑量的估算。有少量研究已開始關(guān)注該方法用于局部受照劑量估算的可行性。

關(guān)于PCC制備方法，最近主要是圍繞用化學(xué)試劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的方法，這些化學(xué)物質(zhì)主要是花萼海綿誘癌素A（Calyculin A）和岡田酸（okadaic acid）。早期是細(xì)胞培養(yǎng)開始后46 h加入這些化學(xué)物質(zhì)，作用2 h后收獲。最近的研究表明，1～10 Gy照射的外周血樣本培養(yǎng)40 h或42 h所得到的PCC環(huán)（PCC-R）的結(jié)果與培養(yǎng)48 h的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義[24]。為了更快地獲得PCC標(biāo)本，有研究用花萼海綿誘癌素A、ATP、p34（cdc2）/cyclin B激酶作用6～12 h，就可以大量得到各個細(xì)胞周期的PCC。在此基礎(chǔ)上，最近的研究用間期細(xì)胞，不用有絲分裂刺激劑使細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，加入ATP、p34（cdc2）/cyclin B激酶，培養(yǎng) 3～6 h，就可以獲得PCC標(biāo)本，用FISH方法來判定染色體畸變，大大提高了分析的可靠性[25]。

關(guān)于用于劑量估算的PCC指標(biāo)，研究最多、應(yīng)用最廣的是PCC-R，在日本東海事故和中國太原事故[26]中得到實際的應(yīng)用。除了最常用的PCCR，還有探索細(xì)胞中染色體和染色體片段總數(shù)目、最長與最短染色體長度比、最長染色體長寬比以及PCC指數(shù)等指標(biāo)來進(jìn)行劑量-效應(yīng)的研究[24，27-28]。最近的研究利用離體照射的外周血PCC標(biāo)本，分析0～10 Gy電離輻射后細(xì)胞周期進(jìn)展系數(shù)（cell cycle progression index，CPI），CPI為G2/M-PCC與G1-PCC之比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPI與照射劑量之間為指數(shù)關(guān)系，CPI不受性別和個人差異的影響。因為分析1例CPI的時間少于15 min，因此作者認(rèn)為CPI分析可在事故早期獲得受照人員生物劑量的結(jié)果[29]。

1.4 FISH分析染色體易位

FISH技術(shù)分析染色體易位主要用于回顧性劑量重建。用FISH分析染色體易位的方法基本完善，目前的研究主要用于回顧性劑量估算的可行性，包括是否需要扣除易位本底發(fā)生率、受照后多長時間估算劑量不會顯著降低（即染色體易位率穩(wěn)定的時段）、低估的劑量能否通過轉(zhuǎn)換系數(shù)提高估算的準(zhǔn)確率等方面。我們的研究中用已知事故當(dāng)時有dic估算的生物劑量資料的受照人員，在不同時間后用FISH技術(shù)進(jìn)行回顧性劑量重建，比較兩種估算劑量的差別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在受照后10年內(nèi)用FISH回顧性重建的劑量與事故當(dāng)時的生物劑量無顯著性差別，超過10年的回顧性重建的劑量顯著低于事故當(dāng)時的生物劑量。兒童期受照易位率下降的速度更快[30]。

2 分子生物學(xué)劑量指標(biāo)的研究進(jìn)展

分子生物學(xué)水平的生物劑量學(xué)新指標(biāo)的研究主要圍繞電離輻射所致的DNA損傷、基因表達(dá)水平（RNA）和蛋白質(zhì)水平改變。這些指標(biāo)的優(yōu)勢是可以實現(xiàn)快速、高通量分析；不足是輻射特異性差、個體差異大和影響因素多，因此目前還沒有可以替代dic和CBMN分析的指標(biāo)。

2.1 DNA雙鏈斷裂相關(guān)指標(biāo)

輻射誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂水平可以用單細(xì)胞凝膠電泳和磷酸化H2AX（phosphorylated histone H2AX，γ-H2AX）分析方法來測定。單細(xì)胞凝膠電泳，也稱彗星分析，從單細(xì)胞水平分析DNA鏈斷裂的程度。有研究證實尾長和尾距均與照射劑量成正比[31]。但是，該方法適用的時間范圍需要進(jìn)一步研究，因為DNA修復(fù)系統(tǒng)很快使DNA雙鏈斷裂水平迅速降低。目前研究最多的是輻射誘導(dǎo)的γ-H2AX水平分析。

真核細(xì)胞中的DNA不是游離存在的，而是與組蛋白和非組蛋白形成復(fù)合物。生物體接受電離輻射照射時，H2AX基因編碼的組蛋白在DNA雙鏈斷裂處產(chǎn)生的γ-H2AX對DNA的這種損傷能夠做出快速敏感的反應(yīng)。細(xì)胞在電離輻射作用后，幾分鐘內(nèi)H2AX即可迅速發(fā)生磷酸化并在DNA雙鏈斷裂位點簇集形成焦點。對γ-H2AX水平的分析，目前主要有兩種方法：一是免疫熒光方法分析γ-H2AX焦點，二是用流式細(xì)胞儀分析γ-H2AX蛋白水平。最近的研究不僅分析γ-H2AX焦點，還同時分析p53結(jié)合蛋白1（p53 binding protein 1，53BP1）等其他DNA雙鏈斷裂焦點[32]。Lamkowski等[33]用49 Gy局部照射哥廷根迷你豬腰部后4、24和 168 h分析外周血 DNA損傷焦點（γ-H2AX、53BP1和有絲分裂重組蛋白11）的形成，結(jié)果表明，如果細(xì)胞內(nèi)焦點發(fā)生大片融合或者細(xì)胞內(nèi)焦點數(shù)目多而使其偏離泊松分布，可能提示受到急性大劑量局部照射。

照射劑量與γ-H2AX水平之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系不僅在離體照射的人外周血淋巴細(xì)胞中得到證實，而且在大鼠和靈長類動物中均可觀察到。不僅低傳能線密度射線誘導(dǎo)的γ-H2AX水平具有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，中子等高傳能線密度射線也可建立R2較高的劑量效應(yīng)曲線。最近有研究比較了中子照射和60Co γ射線誘導(dǎo)γ-H2AX的特點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中子誘導(dǎo)的γ-H2AX絕對水平低于γ射線，但前者穩(wěn)定存在的時間長[34]。有研究用淋巴細(xì)胞亞群特異的細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)合多色流式分析γ-H2AX水平，提示這種方法可以更準(zhǔn)確地反映淋巴細(xì)胞某些亞群的輻射敏感性[35]。國內(nèi)Wang等[36]的研究中利用流式細(xì)胞儀分析淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞中的γ-H2AX水平，發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞中的γ-H2AX水平在各劑量點變化不大，可作為內(nèi)參；而且淋巴細(xì)胞中γ-H2AX水平經(jīng)內(nèi)參調(diào)整，使個體差異性降低，有利于劑量估算準(zhǔn)確率的提高。

最近的兩項研究著重探索大規(guī)模核與輻射事故情況下快速分析γ-H2AX水平來估算劑量的可行性，研究發(fā)現(xiàn)可以用少量血（0.1 ml）、甚至是指尖血來進(jìn)行高通量、自動化γ-H2AX水平分析，大大提高了分析和估算劑量的速度[32，37]。

在歐盟已經(jīng)組織了γ-H2AX焦點生物劑量技術(shù)比對，有8個實驗室參與[38]。比對的內(nèi)容分為兩部分：一部分來自8個受照樣品的200個圖片的焦點分析，另一部分是在照后4～24 h內(nèi)獲得10個新鮮血液樣品，進(jìn)行γ-H2AX焦點分析，并估算劑量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然各實驗室建立的劑量效應(yīng)曲線差異比較大，但是劑量估算的結(jié)果差異不很顯著。作者認(rèn)為兩種方式均可以快速鑒別大劑量受照者，以便進(jìn)行更為準(zhǔn)確的生物劑量估算。

2.2 基因表達(dá)改變

關(guān)于基因表達(dá)作為輻射生物劑量計的研究，目前主要集中在輻射敏感基因組合的組成、如何降低個體及分析的變動性、全身受照人員的驗證等方面。

有研究認(rèn)為，3～20個基因組合可以用來有效地估算受照劑量[39]。Chauhan等[40]用0～1.5 Gy的α粒子照射外周血24 h后，測定其基因表達(dá)水平的改變，發(fā)現(xiàn)各劑量均發(fā)生改變的基因有29個。與X射線相比，α粒子并沒有誘導(dǎo)出不同的基因發(fā)生表達(dá)改變，只是發(fā)生基因表達(dá)改變的倍數(shù)不同而已。Tucker等[41]用0～10 Gy的60Co γ射線照射60例成年供血者，0.5、1和2 d后用實時熒光定量PCR分析經(jīng)過篩選的121個基因的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3～4個基因（其中包括星觸蛋白2、細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶抑制劑1A、生長分化因子 15和共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴張突變基因）的表達(dá)變化在各時間點均非常明顯。在0～6 Gy范圍內(nèi)實際照射劑量與預(yù)期劑量非常一致，超過8 Gy就達(dá)到飽和。但我們的研究發(fā)現(xiàn)，在0～10 Gy照射劑量范圍內(nèi)，P53可誘導(dǎo)基因3表達(dá)水平在72 h內(nèi)與劑量成直線關(guān)系[42]。

由于個體之間放射敏感性和機體狀態(tài)的差異，使得用基因表達(dá)來估算劑量的準(zhǔn)確率大大降低，F(xiàn)orrester等[43]的研究結(jié)果認(rèn)為，選擇順式相關(guān)內(nèi)參基因可以提高估算劑量的準(zhǔn)確率。Lucas等[44]介紹了一種探索基因表達(dá)水平輻射生物劑量學(xué)指標(biāo)的新途徑，首先整體照射小鼠等動物模型，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行人外周血離體照射和全身照射治療患者的基因表達(dá)改變分析。作者認(rèn)為后兩者的結(jié)合（離體照射和全身照射患者的分析）可以很準(zhǔn)確地預(yù)測人員照后狀態(tài)。雖然全身受照患者的樣本比較小，但是區(qū)分患者劑量水平的準(zhǔn)確性不受性別、診斷或前期化療的影響。將這些輻射敏感基因引入快速高通量的化學(xué)連接依賴探針擴增分析（chemical ligationdependent probe amplification assay，CLPA），該方法可以獲得離體照射和整體照射的外周血樣品的準(zhǔn)確受照劑量。因此作者認(rèn)為CLPA可以作為生物劑量分析的候選方法。

2.3 蛋白質(zhì)水平改變

輻射誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平改變的研究主要集中在蛋白質(zhì)組學(xué)篩選，用雙向蛋白質(zhì)電泳或質(zhì)譜掃描分析篩選獲得的輻射敏感蛋白質(zhì)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行詳細(xì)定量研究。目前的研究均有各自的發(fā)現(xiàn)，但是能夠在多個研究中可重復(fù)存在的與輻射相關(guān)的蛋白質(zhì)種類很少。目前的研究仍集中在小鼠、大鼠和靈長類模型的分析。

最近的研究用受到不同劑量照射后的小鼠篩選出多種輻射敏感蛋白質(zhì)，其中有8個人類蛋白質(zhì)的類似物。Deperas-Kaminska等[45]對8個特定蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，觀察16例進(jìn)行射線束外照射放療的乳腺癌患者在照射2、10和20 Gy當(dāng)天或者46～50 Gy后一個月（均是每天照射2 Gy，分別照射1、5、10和23～25次）蛋白質(zhì)水平變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清阿普脂蛋白E（Apolipoprotein E）和泛酸酯激酶4（pantothenate kinase 4）水平可以用來區(qū)分患者受到的照射劑量是大于2 Gy還是小于2 Gy、大于10 Gy還是小于10 Gy。

3 其他檢測方法的探索

3.1 代謝組學(xué)研究進(jìn)展

用于輻射生物劑量計篩選的代謝組學(xué)主要集中在對小鼠、大鼠和靈長類的研究，所用樣品為尿液，一般采用高效液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合分析尿中的代謝物水平，研究結(jié)果顯示，有一些代謝物的改變在輻照后的各種實驗動物中共同存在。

Sharma等[46]利用已經(jīng)建立的大鼠模型進(jìn)行研究，全身照射或腎臟局部照射10 Gy X射線后24 h，用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合儀或質(zhì)譜分析尿蛋白組份改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，照射后尿蛋白/肌酐比值、尿白蛋白降低，全身照射比局部照射降低程度更大。急性期或急性腎損傷時，尿液中半胱氨酸超家族蛋白和α-1-酸性糖蛋白增多；在蛋白酶和蛋白酶抑制劑中，血管舒緩素相關(guān)肽酶b24、糜蛋白酶類似活性前體和產(chǎn)物水平增高；氧化組胺升高。因此，作者認(rèn)為，照射后早期進(jìn)行尿蛋白質(zhì)組學(xué)分析可以提供輻射生物劑量學(xué)指標(biāo)。有研究鑒定靈長類的尿代謝標(biāo)志物是否與嚙齒類相同。每組6個類人猿，照射不同劑量的60Coγ射線（0、1.0、3.5、6.5和8.5Gy），經(jīng)高壓液相色譜和飛行時間質(zhì)譜分析，得到13個由輻射誘導(dǎo)的標(biāo)志物，其中增高的是乙酰?；撬岷土u基乙磺酸、降低的是黃嘌呤和次黃嘌呤，和前期鼠類研究結(jié)果一致[47]。

最近，有學(xué)者首次用輻射代謝組學(xué)方法分析照射前后人尿液中代謝物的變化。選取全身照射的患者，單次照射1.25 Gy后4～6 h、或3.75 Gy分3次照射（1.25 Gy/次）后24 h收集尿液進(jìn)行高壓液相色譜和飛行時間質(zhì)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，照射前后有7個標(biāo)志物水平發(fā)生變化，其中4個與脂肪酸跨線粒體轉(zhuǎn)運進(jìn)行β氧化有關(guān)，包括3-甲基賴氨酸、肉毒堿共軛的乙酰肉毒堿、癸?；舛緣A、辛?；舛緣A；另外3個是嘌呤代謝終產(chǎn)物，包括次黃嘌呤、黃嘌呤、尿酸。該研究還發(fā)現(xiàn)這些代謝變化在性別間是不同的[48]。

3.2 血清學(xué)研究

血清中微量元素水平變化作為輻射生物劑量計的最新研究主要集中在國內(nèi)南京航空航天大學(xué)張海黔的實驗室。對小鼠模型全身照射后，測定小鼠外周血（眼眶靜脈血）中銅、鋅和鐵的水平變化[49-51]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清銅在1～7 Gy照射劑量范圍內(nèi)隨著劑量的增加而降低，其降低可以持續(xù)28 d；血清鋅在照射1、2、4和8 Gy后水平也是隨著劑量的增加而降低，可持續(xù)21 d；而血清鐵在0.5～7 Gy范圍內(nèi)與照射劑量成正比。此研究顯示血清中銅、鋅和鐵水平有望成為快速生物劑量計。但是這些研究結(jié)果有待其他實驗室的驗證。

3.3 電子自旋共振（electronparamagneticresonance，EPR）新進(jìn)展

EPR用于劑量估算的研究原來主要集中在牙釉、骨等的測定，結(jié)果非常準(zhǔn)確、可重復(fù)測量，但是測定均為破壞性，而且牙齒在體測定的誤差較大。最近的研究除了完善牙釉和骨的前處理和測定方法外，主要集中在對人的指甲或趾甲、頭發(fā)的EPR測定上。

Trompier等[52]的研究分成兩批試驗：一是用15名供者的90個指甲樣品，進(jìn)行樣品制備和無本底信號影響的信號譜分析，結(jié)果表明，實際輻射誘導(dǎo)信號和信號譜分析獲得的輻射誘導(dǎo)信號是一致的；信號強度與照射劑量（0～6 Gy）之間為直線關(guān)系。二是用16名供者的96個指甲樣品來驗證信號譜擬合模型，此時考慮了本底信號。同樣表明信號強度與照射劑量之間為直線關(guān)系。雖然發(fā)現(xiàn)個體差異對估算劑量的影響，但是該研究提示用人指甲估算劑量的可行性。He等[53]研究證實，手指甲或腳趾甲角蛋白基質(zhì)中輻射誘導(dǎo)信號是穩(wěn)定的。研究認(rèn)為用EPR方法測定指甲中的自由基信號來估算劑量，其優(yōu)點是指甲或趾甲是普遍存在的、容易獲得、無侵害性、有潛力實現(xiàn)快速劑量估算；缺點是樣品制備過程中機械來源的信號和輻射誘導(dǎo)信號的交叉，并且有很多因素（指甲組成、溫度、濕度、水份和氧水平）會影響信號譜的測定和劑量估算。

對人頭發(fā)進(jìn)行EPR測定的研究很少。Tepe Cam等[54]收集女性頭發(fā)樣品，按照頭發(fā)的顏色、供者年齡、自然或染色分類，將自然黑、紅、金色頭發(fā)和染成黑色的頭發(fā)進(jìn)行照射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPR信號譜的峰高和g值是依賴顏色的，黑色頭發(fā)樣品之間的譜構(gòu)成和信號強度變異小。不同顏色頭發(fā)的EPR信號強度在室溫下降低一半的時間不同，紅色頭發(fā)降得最快，黑色頭發(fā)最慢。該結(jié)果提示用黑色頭發(fā)進(jìn)行ESR測定信號強度變異小且穩(wěn)定。

4 小結(jié)與展望

由于隨時存在著恐怖襲擊事件發(fā)生的可能性，發(fā)生后情況非常復(fù)雜，可能有大人群受到意外照射，這就需要對人群快速分類，需要快速高通量的生物劑量計[55]。因此快速高通量的輻射生物劑量計的建立和應(yīng)用依然是目前研究的重點。世界衛(wèi)生組織在2007年12月啟動了國際生物劑量網(wǎng)絡(luò)（Bio-DoseNet），意在組織全世界的生物劑量力量應(yīng)對大規(guī)模事故的處置。歐盟也建立了由16個國家的23個實驗室組成的歐洲生物劑量網(wǎng)絡(luò)（RENEB）。主要是運行平臺建設(shè)、比對演練、技術(shù)培訓(xùn)、質(zhì)量保證、新技術(shù)和新合作者的尋找等[56]。各大洲也相繼建立各自的生物劑量網(wǎng)絡(luò)，我國同樣需要建立生物劑量網(wǎng)絡(luò)，盡快提高網(wǎng)絡(luò)實驗室的實力，真正能夠在發(fā)生大規(guī)模核與輻射事故情況下快速給出生物劑量估算。

在目前所有的生物劑量計中，dic和微核分析依然是應(yīng)用最廣泛和最可靠的指標(biāo)[57]，目前的研究重點是自動化分析技術(shù)的成熟和完善。由于目前的分子生物學(xué)相關(guān)指標(biāo)可以實現(xiàn)高通量分析，雖然不能達(dá)到輻射特異性的要求，對其影響因素系統(tǒng)研究，但能夠定量其他因素的影響程度，也會提供有用的生物劑量信息。因此，多個生物劑量學(xué)指標(biāo)聯(lián)合分析是未來的方向。

［1］Swartz HM,Williams BB,Flood AB.Overview the principles and practice of biodosimetry[J].Radiat Environ Biopys,2014,53（2）：221-232.

［2］王繼先,金璀珍,白玉書,等.放射生物劑量學(xué)[M].北京：原子能出版社,1997.

［3］金璀珍.放射生物劑量估計[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社, 2002.

［4］Ray FA,Zimmerman E,Robinson B,et al.Directional genomic hybridization for chromosomal inversion discovery and dectection[J]. Chromosome Res,2013,21（2）：165-174.

［5］Ray FA,Robinson E,McKenna M,et al.Directional genomic hybridization：inversions as a potential biodosimeter for retrospective radiation exposure[J].Radiat Environ Biophys,2014,53（2）：255-263.

［6］Rogan PK,Li Y,Wickramasinghe A,et al.Automating dicentric chromosome detection from cytogenetic biodosimetry data[J].Radiat Prot Dosimetry,2014,159（1-4）：95-104.

［7］Gruel G,Gregoire E,Lecas S,et al.Biological dosimetry by automated dicentric scoring in a stimulated emergency[J].Radiat Res, 2013,179（5）：557-569.

［8］Beaton LA,Ferrarotto C,Kutzner BC,et al.Analysis of chromosome damage for biodosimetry using flow cytometry[J].Mutat Res,2013,756（1-2）：192-195.

［9］De Amicis A,De Sanctis S,Di Cristofaro S,et al.Dose estimation using dicentric chromosome assay and cytokinesis block micronucleus assay：comparison between manual and automated scoring in triage mode[J].Health Phys,2014,106（6）：787-797.

［10］Romm H,Ainsbury E,Barnard S,et al.Automatic scoring of dicentric chromosome as a tool in large scale radiation accidents[J].Mutat Res,2013,756（1-2）：174-183.

［11］Romm H,Ainsbury E,Bajinskis A,et al.Web-based scoring of the dicentric assay,a collaborative biodosimetric scoring strategy for population triage in large scale radiation accidents[J].Radiat Environ Biophys,2014,53（2）：241-254.

［12］Sugarman SL,Livingston GK,Stricklin DL,et al.The Internet’s role in a biodosimetric response to a radiation mass casualty event [J].Health Phys,2014,106（5 Suppl）：S65-70.

［13］Tucker JD,Vadapalli M,Joiner MC,et al.Estimating the lowest detectable dose of ionzing radiation by the cytokinesis-block micronucleus assay[J].Radiat Res 2013,180（3）：284-291.

［14］Baeyens A,Swanson R,Herd O,et al.A semi-automated micronucleus-centromere assay to assess low-dose radiation exposure in human lymphocytes[J].Int J Radiat Biol,2011,87（9）：923-931.

［15］Rodrigues MA,Beaton-Green LA,Kutzner BC,et al.Multi-parameter dose estimations in radiation biodosimetry using the automated cytokinesis-block micronucleus assay with imaging flow cytometry [J].Cytometry A,2014,85（10）：883-893.

［16］Francois M,Hochstenbach K,Leifert W,et al.Automation of the cytokinesis-block micronucleus cytome assay by laser scanning cytometry and its potential application in radiation biodosimetry[J]. Biotechniques,2014,57（6）：309-312.

［17］Lyulko OV,Garty G,Randers-Pehrson G,et al.Fast image analysis for the micronucleus assay in a fully automated high-throuput biodosimetry systems[J].Radiat Res,2014,181（2）：146-161.

［18］De Sanctis S,De Amicis A,Di Cristofaro S,et al.Cytokinesis-block micronucleus assay by manual and automated scoring：calibration curves and dose prediction[J].Health Phys,2014,106（6）：745-749.

［19］Repin M,Turner HC,Garty G,et al.Next generation platforms for high-throughput biodosimetry[J].Radiat Prot Dosimetry,2014,159（1）：105-110.

［20］Fenech M.Cytokinesis-block micronucleus cytome assay[J].Nat Protoc,2007,2（5）：1084-1104.

［21］Fenech M.The lymphocyte cytokinesis-block micronucleus cytome assay and its application in radiation biodosimetry[J].Health Phys, 2010,98（2）：234-243.

［22］Zhao H,Lu X,Li S,et al.Characteristics of nucleoplasmic bridges induced by60Co γ-rays in human peripheral lymphocytes[J].Mutagenesis,2014,29（1）：49-54.

［23］Caradonna F.Nucleoplasmic bridges and acrocentric chromosome associations as early markers of exposure to low levels of ionising radiation in occupationally exposed hospital workers[J].Mutagenesis,2015,30（2）：269-275.

［24］Romero I,Lamadrid AI,Gonzalez JE,et al.Shortening the culture time in cytogenetic dosimetry using PCC-R asay[J].Radiat Prot Dosimetry,2014,2015,163（4）：424-429.

［25］Pathak R,Prasanna PG.Premature chromosome condensation in human resting peripheral blood lymphocytes without mitogen stimulation for chromosome aberration analysis using specific whole chromosome DNA hybridization probes[J].Methods Mol Biol,2014, 1105：171-181.

［26］Yao B,Li Y,Liu G,et al.Estimation of the biological dose received by five victims of a radiation accident using three different cytogenetic tools[J].Mutat Res,2013,751（1）：66-72.

［27］Gonzalez JE,Romero I,Gregoire E,et al.Biodosimetry estimation using the ratio of the longest： shortest length in the premature chromosome condensation（PCC）method applying autocapture and automatic image analysis[J].J Radiat Res,2014,55（5）：862-865.

［28］趙驊,陸雪,陳德清,等.早熟染色體凝聚最長染色體長寬比和最長與最短染色體長度比作為輻射損傷指標(biāo)的研究[J].癌變·畸變·突變,2011,23（2）：137-140.

［29］Miura T,Nakata A,Kasai K,et al.A novel parameter,cell-cycle progression index,for radiation dose absorbed estimation in the premature chromosome condensation assay[J].Radiat Prot Dosimetry,2014,159（1-4）：52-60.

［30］Liu QJ,Lu X,Zhao XT,et al.Assessment of retrospective dose estimation,with fluorescence in situ hybridization（FISH）,of six victims previously exposed to accidental ionizing radiation[J].Mutat Res,2014,759（1）：1-8

［31］Wang Y,Xu C,Du LQ,et al.Evaluation of the comet assay for assessing the dose-response relationship of DNA damage induced by ionizing radiation[J].Int J Mol Sci,2013,14（11）：22449-22461.

［32］Turner HC,Sharma P,Perrier JR,et al.The RABiT：high-throuput technology for assessing global DSB repair[J].Radiat Environ Biophys,2014,53（2）：265-272.

［33］Lamkowski A,Forcheron F,Agay D,et al.DNA damage focus analysis in blood samples of minipig reveals acute partial body irradiation[J/OL].PLoS One,2014,9（2）：e87458[2015-05-10].http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24498326.

［34］Vandersickel V,Beukes P,Van Bockstaele B,et al.Induction and disappearance of γ-H2AX foci and formation of micronuclei after exposure of human lymphocytes to60Co γ-rays and p（66）+Be（40）neutrons[J].Int J Radiat Biol,2014,90（2）：149-158.

［35］Zarybnicka L,Vavrova J,Havelek R,et al.Lymphocyte subsets and their H2AX phosphorylation in response to in vivo irradiation in rats [J].Int J Radiat Biol,2013,89（2）：110-117.

［36］Wang ZD,Hu HL,Hu M,et al.Ratio of γH2AX level in lymphocytes to that in granulocytes detected using flow cytometry as a potential biodosimeter for radiation exposure[J].Radiat Environ Biophys,2014,53（2）：283-290.

［37］Moquet J,Barnard S,Rothkamm K,et al.Gamma-H2AX bodosimetry for use in large scale radiation incidents：comparison of rapid’96 well lyse/fix protocol with a routine method[J/OL].Peer J,2014, 2：e282[2015-05-10].http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 24688860.

［38］Barnard S,Ainsbury EA,Al-Hafidh J,et al.The first gamma-H2AX biodosimetry intercomparison exercise of the developing European biodosimetry network RENEB[J].Radiat Prot Dosimetry,2015,164（3）：265-270.

［39］Roy L,Gruel G,Vaurijoux A.Cell response to ionising radiation aralysed by gene expression patterns[J].Ann 1st Super sarita,2009, 49（3）：272-277.

［40］Chauhan V,Howland M,Wilkins R.Identification of gene-based response in human blood cells exposed to alpha particle radiation [J].BMC Genomics,2014,7：43.

［41］Tucker JD,Joiner MC,Thomas RA,et al.Accurate gene expression-based biodosimetry using minimal set of human gene transcripts[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2014,88（4）：933-939.

［42］Liu QJ,Zhang DQ,Zhang QZ,et al.Dose-effect of ionising radiation-induced PIG3 gene expression alteration in human lymphoblastoid AHH-1 cells and human peripheral blood lymphocytes [J].Int J Radiat Biol,2015,91（1）：71-80.

［43］Forrester HB,Sprung CN.Intragenic controls utilizing radiation-induced alternative transcript regions improves gene expression biodosimetry[J].Radiat Res,2014,181（3）：314-323.

［44］Lucas J,Dressman HK,Suchindran S,et al.A translatable predictor of human radiation exposure[J/OL].PLoS One,2014,9（9）：e107897[2015-05-10].http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 25255453.

［45］Deperas-Kaminska M,Bajinskis A,Marczyk M,et al.Radiation-induced changes in levels of selected proteins in peripheral blood serum of breast cancer patients as a potential triage biodosimeter for large-scale radiological emergencies[J].Health Phys,2014,107（6）：555-563.

［46］Sharma M,Moulder JE.The urine proteome as a radiation biodosimeter[J].Adv Exp Med Biol,2013,990：87-100.

［47］Johnson CH,Patterson AD,Krausz KW,et al.Radiation metabolomics.5.Identification of urinary biomarkers of ionizing radiation exposure in nonhuman primates by mass spectrometrybased metabolomics[J].Radiat Res,2012,178（4）：328-340.

［48］Laiakis EC,Mak TD,Anizan S,et al.Development of a metabolomic radiation signature in urine from patients undergoing total body irradiation[J].Radiat Res,2014,181（4）：350-361.

［49］Zhang XH,Min XY,Wang AL,et al.Development of serum copperbased biological dosimetry in whole body gamma irradiation of mice [J].Health Phys,2013,105（4）：351-355.

［50］Min XY,Zhang XH,Zhou QP,et al.Development of serum zinc as a biological dosimeter in mice[J].Int J Radiat Biol,2014,90（10）：909-913.

［51］Zhang XH,Lou ZC,Wang AL,et al.Development of serum iron as a biological dosimeter in mice[J].Radiat Res,2013,179（6）：684-689.

［52］Trompier F,Romanyukha A,Reyes R,et al.State of the art in nail dosimetry：free radicals identification and reaction mechanisms[J]. Radiat Environ Biophys,2014,53（2）：291-303.

［53］He X,Swarts SG,Demidenko E,et al.Development and validation of an ex vivo electron paramagentic resonance fingernail biodosimetric method[J].Radiat Prot Dosimetry,2014,159（4）：172-181.

［54］Tepe Cam S,Polat M,Seyhan N.The use of human hair as biodosimeter[J].Appl Radiat Isot,2014,94：272-281.

［55］Swartz HM,Flood AB,Williams BB,et al.Comparison of the needs for biodosimetry for large-scale radiation events for military versus civilian populations[J].Health Phys,2014,106（6）：755-763.

［56］Kulka U,Ainsbury L,Atkinson M,et al.Realising the European networkofbiodosimetry：RENEB-statusquo[J].RadiatProtDosimetry,2015,164（1-2）：42-45.

［57］Rothkamm K,Beinke C,Romm H,et al.Comparison of established and emerging biodosimetry assays[J].Radiat Res,2013,180（2）：111-119.

Progress on the radiation biodosimetry study

Cai Tianjing,Liu Qingjie.China CDC Key Laboratory of Radiological Protection and Nuclear Emergency,National Institute for Radiological Protection,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 100088,China

Liu Qingjie,Email:qjliu@nirp.cn

Radiation biodosimetry plays an important role in the medical treatment of each radiation accident,mainly by dicentric and cytokinesis-block micronucleus（CBMN）analyses.Biodosimetry studies focus on the rapid and high-throughput radiation biodosimeter.These studies include not only the automatic analyses of dicentric and CBMN,but also the molecular markers,such as DNA double-strand break and gene and protein expression.Metabolomic and serology analyses are also explored.The new progress in radiation biodosimetry over the past three years was reviewed in this paper.

Radiation biodosimetry;Cytogenetics;Fast high-throuput;Molecular biology

2015-05-11）

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2015.04.010

國家自然科學(xué)基金（30870749,81172593）

100088北京，中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，輻射防護(hù)與核應(yīng)急中國疾病預(yù)防控制中心重點實驗室

劉青杰（Email：qjliu@nirp.cn）