冉曦 王明科 冉新澤 王艾平

miRNAs在放射醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

冉曦 王明科 冉新澤 王艾平

microRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，通過與靶mRNA特異性的結(jié)合而導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制其翻譯，對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，進(jìn)而影響各種生命活動。大量研究表明，miRNAs與輻射致癌效應(yīng)、輻射增敏效應(yīng)、腫瘤輻射抗拒和輻射旁效應(yīng)密切相關(guān)，已成為放射醫(yī)學(xué)研究的熱點。筆者就miRNAs及其在放射醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用作一綜述。

微小RNAs；放射醫(yī)學(xué)；輻射致癌；輻射增敏；輻射抗拒

自1895年倫琴發(fā)現(xiàn)X射線以來，放射醫(yī)學(xué)經(jīng)歷了近120年的發(fā)展歷程，已成為醫(yī)學(xué)中的一門重要學(xué)科。microRNAs（miRNAs）是一類長19～22個核酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，存在于絕大多數(shù)動植物中，在進(jìn)化中高度保守，其表達(dá)既具有時空特異性，也具有組織和細(xì)胞的特異性，可通過作用于靶mRNA的3’UTR（3’非翻譯區(qū)）使其靶基因降解或抑制其翻譯，廣泛地參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、代謝和凋亡等生命活動[1-2]。筆者就miRNAs及其在放射醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用作一概述。

1 miRNAs

miRNAs與一般的mRNA一樣，是由RNA聚合酶Ⅱ在核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，經(jīng)過加工（主要是5’端的加帽和3’端的多聚腺苷化）形成的產(chǎn)物稱為pri-miRNAs（primary transcripts of miRNA genes）；隨后經(jīng)歷兩次剪切過程，第一次在核內(nèi)，被微處理器（microprocessor，由RNaseⅢ酶Drosha和DGCR8構(gòu)成）剪切成60～70個核苷酸的pre-miRNAs（precursor miRNAs），Drosha執(zhí)行酶切功能，DGCR8進(jìn)行定位；第二次在核外，pre-miRNAs在Exportin-5蛋白和Ran-GTP幫助下轉(zhuǎn)運出核，再經(jīng)細(xì)胞質(zhì)中的RNaseⅢ酶Dicer剪切成約22個核甘酸的雙螺旋結(jié)構(gòu)，然后由RNA雙鏈解旋酶解螺旋，雙鏈中的其中一條鏈和RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體結(jié)合從而行使其功能，另一條鏈則被降解[3]。目前，已發(fā)現(xiàn)超過15 000個miRNAs且其數(shù)目仍在增加，miRNAs主要通過作用于靶mRNA的3’UTR降解或抑制其靶基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，改變組蛋白修飾及DNA甲基化過程也是其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要機(jī)制[4]。大量文獻(xiàn)證實，miRNAs參與胚胎發(fā)育、腫瘤形成、免疫調(diào)節(jié)、病毒感染、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡和血管發(fā)生等病理生理過程[2，4]，其已成為生命科學(xué)研究的熱點之一[5]。

2 miRNAs與輻射致癌效應(yīng)

輻射致癌效應(yīng)是人類最嚴(yán)重的輻射遠(yuǎn)期效應(yīng)，輻射可引起的腫瘤包括白血病、甲狀腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、多發(fā)性骨髓瘤等[6]。大量研究表明，miRNAs在輻射致癌效應(yīng)中起重要作用。Bueno等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-203表達(dá)下調(diào)使其靶基因ABL1和BCR-ABL1表達(dá)增加，從而參與γ射線誘導(dǎo)的T細(xì)胞淋巴瘤形成。Zhu等[8]研究結(jié)果顯示，輻射可在早期（2 h內(nèi)）激活A(yù)P-1而在晚期（2 h后）激活ErbB/Stat3通路，從而誘導(dǎo)miR-21表達(dá)，促進(jìn)輻射誘導(dǎo)的肝癌形成；而輻射誘導(dǎo)miR-21表達(dá)增加及其靶基因Big-h3降低可能還與小鼠胸腺淋巴瘤的形成有關(guān)[9]。Li等[10]研究表明，miR-23a/b表達(dá)上調(diào)使其靶基因Fas表達(dá)下調(diào)，可能參與輻射誘發(fā)的小鼠胸腺淋巴瘤形成。Iizuka等[11]研究發(fā)現(xiàn)，2 Gy γ射線誘導(dǎo)的乳腺癌樣本較自發(fā)的乳腺癌樣本及正常的乳腺組織中miR-135b、miR-192、miR-194和miR-211表達(dá)要高，miR-192和miR-194在人乳腺癌細(xì)胞系中較非癌細(xì)胞系中表達(dá)也高，抑制miR-194表達(dá)可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和 T47D細(xì)胞的增殖，說明 γ射線誘導(dǎo)miRNAs表達(dá)異常促進(jìn)了細(xì)胞增殖，可能參與了輻射誘導(dǎo)的乳腺癌形成。劉聰[12]應(yīng)用聚類分析法研究發(fā)現(xiàn)，輻射致癌組織與正常組織的總體miRNAs表達(dá)譜有非常明顯的差異，進(jìn)而應(yīng)用SAM軟件統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)在各樣本中表達(dá)重復(fù)性較好、表達(dá)豐度高、表達(dá)差異2倍以上且P<0.001的miRNAs有68條，其中輻射致癌組織中表達(dá)上調(diào)的miRNA有48條，下調(diào)的有20條。同時通過擴(kuò)大樣本Real Time-PCR方法驗證獲得了20條左右差異表達(dá)的miRNAs。以上結(jié)果表明，輻射致癌組織中有眾多miRNAs的表達(dá)異常，且miRNAs可能參與了輻射致癌的發(fā)生，進(jìn)一步研究提示miRNA-23可能是新的與輻射致癌發(fā)病及診斷相關(guān)、重要的miRNA分子標(biāo)簽[12]。

3 miRNAs與輻射增敏效應(yīng)

提高腫瘤組織的輻射敏感性和增強(qiáng)正常組織的輻射耐受性是目前腫瘤放射生物學(xué)研究的重點[13]。miRNAs作為基因調(diào)節(jié)的重要參與者必然參與細(xì)胞輻射敏感性的調(diào)節(jié)[1]。研究miRNAs在腫瘤組織的輻射敏感性中的作用已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。肖海楠等[14]通過MTT比色法檢測肺腺癌A549細(xì)胞的生長抑制率；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；藻紅B染色法觀察細(xì)胞凋亡率；Western blot檢測p53蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染聯(lián)合照射處理組的A549細(xì)胞的抑制率、凋亡率、p53蛋白表達(dá)都較單獨轉(zhuǎn)染或單獨照射組高，且隨著miR-34c轉(zhuǎn)染濃度增加而升高，轉(zhuǎn)染聯(lián)合照射處理組A549細(xì)胞明顯阻滯于G1/G0期，說明miRNA-34c可強(qiáng)化A549細(xì)胞p53蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)A549細(xì)胞G1/G0期阻滯和凋亡，對A549細(xì)胞有輻射增敏效應(yīng)。Wang等[15]研究結(jié)果顯示，電離輻射能引起腎癌細(xì)胞miR-185表達(dá)下調(diào)，而過表達(dá)miR-185則可增加細(xì)胞的輻射敏感性，其機(jī)制是miR-185通過靶向調(diào)控關(guān)鍵DNA損傷傳感因子ATR，從而增強(qiáng)電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及增殖抑制。Upraity等[16]研究發(fā)現(xiàn)，增加miR-224表達(dá)或降低miR-224的靶基因API5表達(dá)，可增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞輻射敏感性；而Lynam-Lennon等[17]研究證實，增加miR-31表達(dá)，可使輻射抗性的食管癌細(xì)胞重新變得對輻射治療敏感。但也有研究發(fā)現(xiàn)，敲除miRNAs合成的關(guān)鍵蛋白Dicer或Drosha及Ago2并不影響肺癌的輻射敏感性[18]。

4 miRNAs與腫瘤輻射抗拒

腫瘤放射治療目前已成為腫瘤治療的重要手段，但腫瘤放射治療中的腫瘤輻射抗拒常影響放射治療的效果[19]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，大量miRNAs參與了腫瘤輻射抗拒過程。陳鑫等[20]構(gòu)建了放射抗拒食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109R、TE-1R，通過與母代細(xì)胞比較，Eca-109R、TE-1R均存在多個明顯差異表達(dá)的miRNA，但僅miR-21在兩種放射抗拒細(xì)胞株的放射抗拒形成前后具有共同的表達(dá)改變趨勢，因而認(rèn)為miR-21的表達(dá)可能與食管鱗癌放射抗拒特性相關(guān)。曲昌菊等[21]在驗證相同遺傳背景鼻咽癌（NPC）細(xì)胞CNE-2R和CNE-2不同輻射抗拒的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，在CNE-2R和CNE-2細(xì)胞中存在miRNA的差異表達(dá)，即與CNE-2細(xì)胞比較，在檢測到的719個miRNA中，CNE-2R細(xì)胞中有37個miRNA上調(diào)，29個下調(diào)，其中檢測量的絕對值≥2000且兩者相差≥2倍的miRNA共12個：hsa-miR-200b、hsa-miR-224、hsa-miR-26b、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-205、hsa-let-7e、hsa-let-7g、hsa-miR-19b、hsamiR-24、hsa-miR-103、hsa-miR-106b和hsa-miR-93，這些差異表達(dá)的miRNA可能與鼻咽癌輻射抗拒相關(guān)。Ke等[22]研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a在放射抗拒的人子宮頸癌標(biāo)本和子宮頸癌細(xì)胞系SiHa和Me180中表達(dá)較高，并通過細(xì)胞培養(yǎng)模型和小鼠體內(nèi)移植模型證實增加的miR-181a降低了其靶基因凋亡相關(guān)蛋白PRKCD，這可能與子宮頸癌輻射抗拒有關(guān)。Anastasov等[23]通過研究輻射敏感的乳腺癌細(xì)胞系MDAMB-361和輻射抗拒的乳腺癌細(xì)胞系T47D發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miR-21導(dǎo)致G2/M阻滯可能是乳腺癌輻射抗拒的重要機(jī)制，anti-miR-21聯(lián)合放射治療對輻射抗拒的乳腺癌具有潛在的治療價值。

5 miRNAs與輻射旁效應(yīng)

電離輻射旁效應(yīng)是指受輻射損傷的細(xì)胞產(chǎn)生的各種信號作用于周圍細(xì)胞，引起了未受照射細(xì)胞出現(xiàn)損傷效應(yīng)。目前電離輻射旁效應(yīng)已成為放射醫(yī)學(xué)的研究熱點[24]。Kovalchuk等[25]利用miRNA芯片研究α粒子對人體組織的輻射旁效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鄰近未照射旁效應(yīng)組c-MYC介導(dǎo)的miR-17-92家族上調(diào)而其靶基因RB1和E2F1下調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期失調(diào)；miR-29家族上調(diào)而其靶基因DNMT3a下調(diào)導(dǎo)致DNA低甲基化；MCL1下調(diào)導(dǎo)致凋亡異常；miR-16表達(dá)上調(diào)而其靶基因BCL2下調(diào)導(dǎo)致凋亡異常。Ilnytskyy等[26]用0.5 Gy X射線照射研究輻射旁效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，皮膚和脾臟的有關(guān)miRNAs的輻射旁效應(yīng)不同，脾臟miRNAs所受影響更大，miR-194在小鼠頭顱照射6 h后脾臟中表達(dá)增加，使其靶基因MeCP2表達(dá)降低，miR-194可能參與了X射線誘導(dǎo)的脾臟旁效應(yīng)。

6 展望

miRNAs已廣泛應(yīng)用于放射醫(yī)學(xué)及創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，但尚有很多問題亟待解決：如miRNAs與腫瘤輻射敏感性有關(guān)，但miRNAs調(diào)節(jié)腫瘤輻射敏感性的機(jī)制還不清楚；提高腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性和降低正常組織的損傷仍是腫瘤放射治療的關(guān)鍵，而目前的研究多集中在miRNAs如何能提高腫瘤輻射敏感性，但是對如何利用miRNAs降低腫瘤放射治療時正常組織的輻射損傷的研究較少，miRNAs參與輻射旁效應(yīng)的作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本實驗室曾對正常皮膚和切割創(chuàng)傷后7 d肉芽的miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了一系列miRNAs的表達(dá)變化，其中miR-21表達(dá)上調(diào)了2倍，相應(yīng)的定量PCR和Northern blot也驗證了這一結(jié)果；同時成功構(gòu)建了小鼠miR-21的真核表達(dá)載體，為深入探討miR-21的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)[27]。原位雜交顯示miR-21可廣泛表達(dá)于新生肉芽組織，而抑制miR-21的表達(dá)則可延緩創(chuàng)面愈合，影響創(chuàng)面早期收縮和重塑期的膠原沉積[28]。目前對miRNAs在放射醫(yī)學(xué)研究中存在的問題，特別是血液、唾液、痰、尿液等體液的miRNAs表達(dá)改變能否作為輻射監(jiān)測的生物標(biāo)志物，能否用于放射性損傷的診斷、放射治療的預(yù)后等方面，都值得進(jìn)一步探索。總之，研究miRNAs在放射醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用可為輻射致癌的診斷、預(yù)防和治療提供重要的新靶點、新方法和新思路。

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MicroRNAs and their applications in radiation medicine

Ran Xi*,Wang Mingke,Ran Xinze,Wang Aiping.*Institute of Combined Injury,School of Military Preventive Medicine,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China

Wang Aiping,Email:waiping2012@163.com;Ran Xinze,Email:ranxinze@163.com

MicroRNAs（miRNAs）are endogenous non-coding RNAs,which can degrade their target mRNAs or inhibit their translation by binding to their target mRNAs specifically.MiRNAs act as post-transcriptional regulators of gene expression,and then are involved in diverse physiological activities. Many studies has shown that miRNAs are closely related with radiation carcinogenesis,radiosensitivity, radioresistance and radiation-induced bystander effects,and have being a hotspot in radiation-medicine research.This review focuses on the introduction of miRNAs and their applications in radiation medicine.

MicroRNAs；Radiation medicine； Radiation carcinogenesis；Radiosensitivity；Radioresistance

2015-01-04）

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2015.04.013

國家自然科學(xué)基金（81172600，81272101）

400038重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院全軍復(fù)合傷研究所（冉曦、王艾平），創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室（冉新澤）；200433上海，海軍醫(yī)學(xué)研究所（王明科）；400037重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院檢驗科（冉曦）

王艾平（Email：waiping2012@163.com）；冉新澤（Email：ranxinze@163.com）