程華 陳小玲 李琳玲 程軍勇 鄧先珍 張雪花 黃兵杰 程水源

摘要：分別采集湖北省羅田縣、麻城市自然分布的28、8株羅田甜柿（Diospyros kaki Thunb cv. Oriental persimmon）古樹優(yōu)系及小澀柿、無核、寶蓋、秋焰甜柿優(yōu)系為研究材料，利用簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增分子標(biāo)記（Inter simple sequence repeat，ISSR）技術(shù)對40個(gè)甜柿優(yōu)系進(jìn)行初步認(rèn)證及親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明：①從21條ISSR引物中篩選出了9條能夠擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定條帶的引物，9條引物共擴(kuò)增出185條譜帶，其中多態(tài)性條帶有185條，多態(tài)性條帶比率為100%;②應(yīng)用NTSYS2.10e軟件對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行非加權(quán)組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚類分析，40個(gè)甜柿優(yōu)系大致被分為兩大類，遺傳相似系數(shù)從0.39到0.92;③羅田甜柿古樹基因資源豐富，每個(gè)基因型都有其獨(dú)特的指紋圖譜，遺傳多樣性高。羅田甜柿優(yōu)系間的親緣關(guān)系與地理來源有一定的相關(guān)性，麻城市與羅田縣地理位置交界區(qū)域的羅田甜柿資源相對集中在A區(qū)，其他地理位置采集優(yōu)系集中在B區(qū)。分析結(jié)果可為羅田甜柿種質(zhì)資源開發(fā)、基因資源保存、后期品種審定及鑒別提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：羅田甜柿（Diospyros kaki Thunb cv. Oriental persimmon）;簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增分子標(biāo)記;種質(zhì)資源;鑒定

中圖分類號：S665.2;Q75;S602.4 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? 文章編號：0439-8114（2015）02-0370-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn 0439-8114.2015.02.029

A Preliminary Identification of the Genetic Resources of Luotian Sweet Persimmon

with ISSR Markers

CHENG Hua1，CHEN Xiao-ling1，LI Lin-ling1，CHENG Jun-yong2，DENG Xian-zhen2，ZHANG Xue-hua1，

HUANG Bing-jie1，CHENG Shui-yuan1

（1. Huanggang Normal University，College of Life Science/Economic Forest Germplasm Improvement and Comprehensive Utilization of Resources of Hubei Key Laboratories，Huanggang，438000，Hubei，China;2.Hubei Academy of Forestry，Wuhan 430075，China）

Abstract： The genetic resources of 28 Luotian sweet persimmon （Diospyros kaki Thunb cv. Oriental persimmon） with ancient major clique and 8 samplea from Luotian county， Macheng city of Hubei province were analyzed with Inter simple sequence repeat （ISSR） markers. Xiaoseshi， Wuhe， Baogai and Qiuyan were used for screening primers. The results shows that 9 dolymorphic primers were screened from a total of 21 ISSR ones. The genomic DNAs of 40 varieties were amplified to obtain a total of 185 bands， with polymorphism rate of 100%. 40 persimmon major cliques were devided into two categories by Unweighted pair-group method with arithmetic means （UPGMA） cluster analysis， using NTSYS2.10e software. The genetic similarity coefficient was ranged from 0.39 to 0.92. Luotian sweet persimmon trees had abundant genetic resources with genetic diversity. It will provide a theoretical foundation for identifying Luotian sweet persimmon cultivars， and effectively utlizing germplasm resources.

Key words： Luotian sweet persimmon （Diospyros kaki Thunb cv. Oriental persimmon）; Inter simple sequence repeat; germplasm resources; identification

柿（Diospyros kaki Thunb）是我國五大木本糧油樹種之一，其果實(shí)、果蒂和葉片富含維生素C、多糖、碘、單寧等營養(yǎng)成分[1]，可廣泛應(yīng)用于食品、藥品、飲料等工業(yè)領(lǐng)域。作為世界上惟一自然脫澀的甜柿品種羅田甜柿（D. kaki cv. Oriental persimmon）在湖北省羅田縣已有千余年的栽培歷史?，F(xiàn)在羅田甜柿是中國地理標(biāo)志產(chǎn)品，種植面積已發(fā)展到0.24萬hm2，年產(chǎn)甜柿0.6萬t，鮮果收入達(dá)1.44億元，是羅田縣極具發(fā)展?jié)摿Φ哪颈炯Z油產(chǎn)業(yè)之一[2]。

柿種內(nèi)的變異極為豐富，芽變品種多，所以品種間的親緣關(guān)系不明析，嚴(yán)重影響了柿資源的推廣、育種親本的選配和栽培立地條件的選擇[3]。由于傳統(tǒng)的植物形態(tài)鑒定存在時(shí)效性較差、容易受到環(huán)境與主觀因素的影響等特點(diǎn)，難以進(jìn)一步弄清羅田甜柿種質(zhì)資源的親緣關(guān)系。因此，利用分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合形態(tài)鑒定手段是理順羅田甜柿親緣關(guān)系的有效途徑。簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（Inter simple sequence repeat，ISSR）分子標(biāo)記是類似隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）標(biāo)記的一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)[4]，是近幾年來在微衛(wèi)星（Microsatellite）分子標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[5];ISSR標(biāo)記能有效揭示種群內(nèi)的遺傳多樣性，進(jìn)而分析其系統(tǒng)分化規(guī)律，研究群體遺傳結(jié)構(gòu)及其多樣性程度[6]。然而ISSR技術(shù)極易受模板、引物以及Taq酶等因素的影響，任何一個(gè)因素的改變都可能使擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生變化。為此需要對甜柿ISSR分子標(biāo)記的反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，使反應(yīng)結(jié)果更加精準(zhǔn)。試驗(yàn)選用ISSR技術(shù)探討了羅田甜柿古老優(yōu)樹種質(zhì)資源的基本情況，以期能夠更快速、準(zhǔn)確、簡便地鑒定這些古老優(yōu)樹間的親緣關(guān)系，從分子學(xué)水平上為羅田甜柿種質(zhì)資源的收集、鑒定和發(fā)展利用提供參考依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料 ?羅田甜柿植物材料為湖北省羅田縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的古老優(yōu)樹28個(gè)樣品，以麻城市不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的8個(gè)樣品作為參照，用羅田縣農(nóng)家品種無核（W）、寶蓋（B）、小澀柿（S）、秋焰（Q）為篩選引物提供參考。每個(gè)樣品隨機(jī)選取10～20片幼嫩葉片，田間采葉后裝入做好標(biāo)記的自封袋中，迅速送到黃岡師范學(xué)院經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃冰箱中冷凍保存。材料來源和編號見表1。

1.1.2 ?主要試劑 ?瓊脂糖、5×TBE緩沖液、2×Taq PCR Master Mix購自北京天根生化科技有限公司;CTAB提取DNA試劑、30%聚丙烯酰胺、過硫酸胺、TEMED、硝酸銀、氫氧化鈉、甲醛、無水乙醇、冰醋酸等購自武漢貝爾生物技術(shù)有限公司;Maker DL2000購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?羅田甜柿基因組DNA的提取與檢測 ?試驗(yàn)參考梁玉琴等[7]的CTAB法，略做改進(jìn)，提取40個(gè)羅田甜柿優(yōu)系葉片的總基因組DNA。在0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳中檢測所提取基因組DNA的質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)檢測DNA的濃度，提取的總DNA保存于-20 ℃冰箱中，備用，-4 ℃為短期存放條件。

1.2.2 ?引物來源及ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立 ?試驗(yàn)所用引物是依據(jù)柿的EST文庫篩選出的ISSR序列，參照加拿大哥倫比亞大學(xué)網(wǎng)站公布的ISSR引物序列，共設(shè)計(jì)出21條擴(kuò)增引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Taq PCR MasterMix反應(yīng)液（0.1 U/μL Taq Polymerase、500 μmol dNTP each、20 mmol Tris-HCl、100 mmol KCl、3 mmol MgCl2 及其他穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑）10 μL，引物2 μL，DNA模板50 ng，ddH2O 加至20 μL。擴(kuò)增程序設(shè)為94 ℃預(yù)變性3 min;然后94 ℃變性30 s，50～56 ℃退火40 s，72 ℃ 3 min，共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3 ?引物篩選 ?選用基因組DNA純度較高的羅田甜柿樣品為模板，分別對21個(gè)引物采用以上擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物先用1%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測，再用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)一步分析，篩選出的多態(tài)性較高的引物用于40個(gè)羅田甜柿樣品的鑒定。

1.3 ?統(tǒng)計(jì)與分析

將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物全部上樣6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，在350 V電壓下電泳約140 min，經(jīng)硝酸銀染色、氫氧化鈉顯影，所獲得的擴(kuò)增條帶以0、1統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫。條帶統(tǒng)計(jì)以其清晰可重復(fù)為基本原則，采用人工讀帶法，在相同遷移位置上有帶記為1、無帶記為0。在NTSYS 2.10e分析軟件中，根據(jù)SM相似系數(shù)法求得品種間的遺傳相似性矩陣，再用非加權(quán)組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)聚類分析樹狀圖[8]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?引物篩選結(jié)果

隨機(jī)選取秋焰的DNA為模板，分別對21條ISSR擴(kuò)增引物進(jìn)行篩選，淘汰無擴(kuò)增產(chǎn)物和多態(tài)性差的引物，選留擴(kuò)增條帶清晰且有明顯多態(tài)性片段的引物，結(jié)果見圖1。根據(jù)瓊脂糖電泳得到的初步檢測結(jié)果，結(jié)合聚丙烯酰胺電泳（圖2）結(jié)果的進(jìn)一步分析，從中篩選出了9個(gè)引物，具體見表2。分析可見，這些引物均能在供試羅田甜柿樣品中擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性和多態(tài)性較高的條帶。如圖1結(jié)果顯示，在泳道2、3、5、7、9、11、13、14、15、17、18、20、21中均有多態(tài)性條帶，說明對應(yīng)編號的引物都可為ISSR引物篩選提供參考，因此對其他泳道沒有顯示多態(tài)性條帶的引物予以淘汰。圖2顯示，泳道2、3、5、7、9、11、13、14、15、17、18、20、21的多態(tài)性條帶數(shù)清晰，再結(jié)合圖1初步篩選的結(jié)果，確定9條引物（表2）用于40個(gè)羅田甜柿優(yōu)系的認(rèn)證和鑒定。

2.2 ?ISSR多態(tài)性分析及指紋分析

用篩選出的9個(gè)引物分別對40個(gè)羅田甜柿樣品提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，共擴(kuò)增出185條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶185條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出20.1個(gè)條帶，平均多態(tài)性位點(diǎn)率為100%，具體結(jié)果見表2。從表2可見，不同引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)有較大的差異，如引物ISSR3、ISSR21擴(kuò)增出的條帶較多，分別為29、27條，而引物ISSR7擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少，僅有14條。從表2還可見，所選擇的引物多態(tài)性達(dá)100%。9條引物能分別建立相應(yīng)的DNA指紋圖譜（因?yàn)閳D多，文中省略），由各引物擴(kuò)增效果所反映出的DNA條帶多態(tài)性能較好地區(qū)分開各個(gè)羅田甜柿的優(yōu)系。

2.3 ?羅田甜柿優(yōu)系間的遺傳相似性分析

用NTSYS2.10e軟件計(jì)算甜柿優(yōu)系間的Dice遺傳相似系數(shù)，結(jié)果見表3。由表3可知，40個(gè)羅田甜柿優(yōu)系間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.39～0.92，平均遺傳相似性系數(shù)為0.71。以羅田縣平湖鄉(xiāng)東沖畈村在海拔148 m處采集的1號優(yōu)系樣品和從羅田縣大崎鄉(xiāng)平頭嶺村海拔588 m處采集的9號優(yōu)系樣品遺傳相似性系數(shù)最大，都為0.92，說明這2個(gè)優(yōu)系親緣關(guān)系很近，有可能源自同一株樹。其次是從東沖畈村海拔98 m、平頭嶺村海拔473 m處采集的3、7號優(yōu)系樣品，相似性系數(shù)都為0.90，表明它們之間的親緣關(guān)系很接近，遺傳差異較小。而從平頭嶺村海拔588 m處采集的9號優(yōu)系樣品與從羅田縣三里畈鎮(zhèn)夏家鋪村海拔296 m處采集的13號優(yōu)系樣品具有最小的遺傳相似性系數(shù)，僅為0.39，可見它們之間的遺傳差異比較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 ?聚類分析

在獲得兩兩不同優(yōu)系間的Dice遺傳相似系數(shù)基礎(chǔ)上，以185個(gè)位點(diǎn)的譜帶為原矩陣，采用UPGMA法構(gòu)建了羅田甜柿優(yōu)系間的遺傳關(guān)系系統(tǒng)聚類分析樹狀圖，具體見圖3。分析表明，聚類樹狀圖與優(yōu)系間的遺傳相似系數(shù)反映出的情況基本一致，即遺傳相似系數(shù)越高，親緣關(guān)系越近，優(yōu)系間的差異就越小。從樹狀圖可以看出，40份優(yōu)系材料間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.39～0.92，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。

當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.60時(shí)，可將40個(gè)優(yōu)系分為A組和B組2個(gè)組。在A組中，麻城市的優(yōu)系全都聚在該組，羅田縣大部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)的優(yōu)系聚在了一起;在B組中，羅田縣部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)的少數(shù)優(yōu)系單獨(dú)聚在了一起，說明不同地域之間的優(yōu)系存在遺傳差異，處在同一鄉(xiāng)鎮(zhèn)的優(yōu)系之間也存在遺傳差異，從而表現(xiàn)出了該地區(qū)野生羅田甜柿的遺傳多樣性;當(dāng)在遺傳相似系數(shù)為0.67處做割線L1時(shí)，可以將來自于不同地域的40份資源優(yōu)系分成4個(gè)亞組。其中A組有3個(gè)亞組A1、A2、A3，B組仍然單獨(dú)聚類成1個(gè)亞組。

當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.73時(shí)，來自于羅田縣三里畈鎮(zhèn)朱元洞村不同海拔的2個(gè)優(yōu)系聚在了一起，獨(dú)自成A3亞組，說明2個(gè)優(yōu)系之間遺傳相似性較高，同時(shí)也說明其與來自于其他地域的類群有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系;在A1亞組中，來自于羅田縣平湖鄉(xiāng)東沖畈村海拔148 m的1號優(yōu)系與來自于羅田縣大崎鄉(xiāng)平頭嶺村海拔588 m的9號優(yōu)系在遺傳相似系數(shù)為0.92時(shí)，聚在了一起，然后又在遺傳相似系數(shù)為0.86時(shí)與來自于羅田縣河鋪鎮(zhèn)丁家山村的海拔613 m的26號優(yōu)系聚在了一起，其中1號和9號形成一支，很有可能是同一個(gè)母源。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.90時(shí)，來自于羅田縣平湖鄉(xiāng)東沖畈村海拔98 m的3號優(yōu)系與來自羅田縣大崎鄉(xiāng)平頭嶺村海拔473 m的7號優(yōu)系聚在了一起;當(dāng)遺傳相似系數(shù)在0.68及以上時(shí)，A2亞組又可以分為2個(gè)小組，分別表述為A21小組和A22小組。在A22小組中，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.78時(shí)，來自于羅田縣河鋪鎮(zhèn)唐家山村海拔397 m的22號優(yōu)系與來自于同鎮(zhèn)的丁家山村海拔564 m的24號優(yōu)系聚在了一起;來自于羅田縣三里畈鎮(zhèn)鏨字石村的2個(gè)優(yōu)系29號和30號也在0.79處相聚，后又在0.75處與同樣來自于鏨字石村的另外一個(gè)優(yōu)系28號相聚在一起。從這個(gè)結(jié)果可以看出，野生羅田甜柿不同種源之間的差異隨著地理距離的遠(yuǎn)近而大小不一。

另外，B組分別為來自于羅田縣三里畈鎮(zhèn)鏨字石村不同海拔的10號、11號、12號3個(gè)優(yōu)系，來自于羅田縣三里畈鎮(zhèn)夏家鋪村不同海拔的13號、14號2個(gè)優(yōu)系，來自于羅田縣平湖鄉(xiāng)毛家洞村的17號、上沖村的18號、大垴村的27號3個(gè)優(yōu)系，等等。值得注意的是同一地域的17號和18號在遺傳相似系數(shù)為0.84時(shí)相聚，而同一地域的27號與它們的遺傳距離相對較遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)為0.67。

從聚類圖的分析中可以看出，在相同的遺傳相似系數(shù)處，來自于不同地域的羅田甜柿優(yōu)系可以聚在一起，說明不同的地域也會有親緣關(guān)系比較近的優(yōu)系;同樣來自于同一地域的優(yōu)系也會具有不同的遺傳相似系數(shù)，說明同一地域的優(yōu)系彼此之間是存在差異的;正是這種交叉的親緣性和差異性才構(gòu)成了羅田甜柿的遺傳多樣性。

3 ?討論

對于要求檢測大量樣品的遺傳多樣性研究來說，檢測手段的穩(wěn)定性至關(guān)重要。影響ISSR-PCR反應(yīng)體系的因素有模版DNA濃度、引物濃度、dNTP、Taq-DNA聚合酶、循環(huán)數(shù)、退火溫度等方面[9]。徐象華等在柿屬（Diospyros L.）親緣關(guān)系研究中完成了RFLP（Restriction fragment length polymorphism）、RAPD、AFLP（Amplified fragment length polymorphism）、SSR（Simple sequence repeats）、ISSR、IRAP（Inter retrotransposon amplified polymorphism）、SRAP（Sequence-related amplified polymorphism）等多種分子標(biāo)記技術(shù)體系的構(gòu)建，側(cè)重于研究國外與國內(nèi)及國內(nèi)不同地區(qū)間種間的親緣關(guān)系[10]。本研究采用ISSR標(biāo)記通過對羅田甜柿不同地理位置的優(yōu)系母樹DNA序列的同源程度分析，試圖確定羅田甜柿種質(zhì)資源分布及地理位置的遺傳差異，以期為進(jìn)一步的種質(zhì)資源保存和優(yōu)系的品種審定提供佐證。

遺傳標(biāo)記是作物遺傳育種研究的重要工具之一，ISSR以其設(shè)備技術(shù)簡單、重復(fù)性高、多態(tài)性豐富的特點(diǎn)將在果樹起源進(jìn)化及系統(tǒng)分類研究方面發(fā)揮重大作用[11]。近年來，公共數(shù)據(jù)庫的EST數(shù)量迅速增加，為ISSR標(biāo)記的開發(fā)提供了一條快速而有效的途徑。不過試驗(yàn)中由21對引物最終僅篩選出了9對多態(tài)性高的引物，說明篩選的效率較低，其原因可能來自兩方面：一是EST數(shù)據(jù)較少，來源單一，所設(shè)計(jì)的引物本身就存在較高的冗余度;二是中國的柿屬植物種間親緣關(guān)系較近，不易得到有多態(tài)性的引物[12]。

果樹在自然界中存在許多天然雜種，不少古老的品種是突變或者自然雜交得到的，其親本來源不明。本次研究的供試材料為湖北省羅田縣、麻城市具有優(yōu)良性狀的古老的羅田甜柿母樹。我們應(yīng)用NTSYS2.10e軟件對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行UPGMA法聚類分析，結(jié)果40個(gè)羅田甜柿優(yōu)系大致被分為兩大類，遺傳相似系數(shù)從0.39到0.92。說明羅田甜柿資源分布具有明顯的自然地理分區(qū)，分區(qū)內(nèi)又具有遺傳多樣性。例如從麻城市采到的優(yōu)系全都聚集在A區(qū)，而同一采集地的優(yōu)系樣品又有差異，如采自羅田縣河鋪鎮(zhèn)丁家山村的26號優(yōu)系就與同樣采摘于丁家山的其他2個(gè)優(yōu)系（24號、25號）相距較遠(yuǎn)，說明相同采集地的優(yōu)系也有親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的情況存在，這可能與早期甜柿的人工移栽種植有關(guān)[10]。

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