徐丹丹 王丕武 趙邯鄲 劉雙 陳昭汀 關(guān)淑艷

摘要：以根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium）EHA105介導(dǎo)外源基因phyA轉(zhuǎn)入玉米（Zea mays L.）自交系GS01的胚性愈傷組織， 并利用除草劑（草胺磷）篩選出抗性愈傷組織，培養(yǎng)并獲得再生植株。結(jié)果表明，菌液濃度及侵染時間顯著影響愈傷組織的轉(zhuǎn)化率;不同激素種類及配比對抗性愈傷組織再生植株的影響明顯。當(dāng)菌液濃度OD600 nm為0.6，侵染時間為20 min時，抗性愈傷組織的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到了68.7%，為玉米農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化并獲得再生植株奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌（Agrobacterium）;玉米（Zea mays L.）自交系;遺傳轉(zhuǎn)化;phyA基因

中圖分類號：S513.032 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）02-0465-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.054

Optimizing Conditions of Transforming phyA Gene into Maize with Agrobacterium

XU Dan-dana，WANG Pi-wub，ZHAO Han-dana，LIU Shuanga，CHENG Zhao-tinga，GUAN Shu-yana

（a.College of Life Sciences;b. College of Agronomy，Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）

Abstract： Foreign gene phyA was transfered to embryonic callus of maize inbred lines GS01 with Agrobacterium EHA105-mediated. Herbicides （alachlor P） were used to screen resistant callus and regenerate plantlets. The results showed that bacteria concentration and infection time affected callus conversion rate significantly. Types of hormone and proportion affected obviously regeneration plantlet of resistant callus. Bacteria concentration was 0.6 at OD600 nm. Infection time was 20 min. Resistant callus rate was high with 68.7%. It will provide a good reference for the regeneration and transformation of maize mediated by Agrobacterium.

Key words： Agrobacterium; maize inbred lines; genetic transformation; phyA gene

玉米（Zea mays L.）是糧食作物中重要的工業(yè)原料，在全世界糧食生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位[1-3]。2010年，我國玉米種植面積達(dá)到了324萬hm2，成為世界第二大玉米生產(chǎn)國，而玉米也成為了我國的“谷物之王”[4]。玉米在我國經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)中占有重要地位，因此大力提高玉米的產(chǎn)量及品質(zhì)，成為了眾多學(xué)者積極探尋的問題[5-7]。植酸酶能有效地水解食物以及土壤中植酸態(tài)有機(jī)磷，釋放出生命體可以直接吸收利用的無機(jī)磷酸及其鐵、鈣、鋅、鎂等鹽類，有效地提高了其生物利用率。因此，植酸酶基因克隆及導(dǎo)入受體組織并獲得可再生植株對研制植酸酶食品或飼料添加劑、開發(fā)高級保健食品和優(yōu)質(zhì)飼料、循環(huán)利用土壤中有機(jī)磷、緩解全球性磷礦產(chǎn)資源危機(jī)等具有重要意義[8-13]。本研究以玉米自交系GS01的胚性愈傷組織為材料，將連有根部特異性啟動子和植酸酶基因phyA的載體轉(zhuǎn)入玉米自交系中，對影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行探討，從而確定了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的最佳菌液濃度及最佳侵染時間，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化條件，并成功獲得玉米抗性苗，為基因工程育種打下了基礎(chǔ)，為獲得含有phyA基因的轉(zhuǎn)基因玉米植株提供了條件，同時為進(jìn)一步提高玉米的產(chǎn)量及品質(zhì)的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?外植體 ?采用玉米自交系GS01的胚性愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 ?菌種 ?含有phyA基因和玉米根部特異啟動子基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmGLU1P-PhyA-Nos的根癌農(nóng)桿菌EHA105，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.1.3 ?培養(yǎng)基 ?本試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基見表1。

1.2 ?方法

1.2.1 ?抗性愈傷篩選標(biāo)記的確定 ?本研究所構(gòu)建的表達(dá)載體為Bar基因的篩選標(biāo)記，篩選培養(yǎng)采用除草劑篩選的方法，即用草胺磷進(jìn)行篩選。

1.2.2 ?農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織

1）農(nóng)桿菌菌液的制備。將帶有質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmGLU1P-PhyA-Nos單菌落，接種于含5 mL卡那霉素的5 mL YEP液體培養(yǎng)基中，于27 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜，再轉(zhuǎn)入50 mL YEP液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600 nm在0.5～0.6）時，收集菌體，重懸于MS液體培養(yǎng)基中待用。

2）玉米愈傷組織的誘導(dǎo)。取授粉12～16 d的玉米自交系GS01的幼穗，先用75%乙醇消毒8～10 min，再用0.5%次氯酸鈉浸泡消毒12～15 min，無菌水洗2～5次后，在無菌條件下取幼胚接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，26 ℃暗培養(yǎng)3～4周，產(chǎn)生Ⅰ型愈傷組織，每隔2～3周繼代1次，誘導(dǎo)出Ⅱ型胚性愈傷組織，作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體材料。

3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織。將含有質(zhì)粒pCA

MBIA3301-ZmGLU1P-PhyA-Nos的農(nóng)桿菌EAH105的單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基（含有50 mg/L 卡那霉素）中，27 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600 nm達(dá)到不同值），收集菌體，用同體積侵染培養(yǎng)基重懸菌體，用此菌液在三角瓶中侵染胚性愈傷組織15～25 min，每隔5 min振蕩1次，然后收集菌體，倒掉菌液，將愈傷組織放入鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干愈傷組織表面多余的菌液，然后轉(zhuǎn)入共體培養(yǎng)基中（附加200 μg/L AS）中27 ℃暗培養(yǎng)3 d左右。

4）愈傷組織的篩選、分化及植株再生。將愈傷組織移入篩選培養(yǎng)基中（含一定濃度的除草劑），篩選生長旺盛的新鮮的抗性愈傷繼代3次（每15～20 d左右繼代1次），抗性愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基中，分化出苗，再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基生根。再移栽到培養(yǎng)室盆栽，最后移栽到大田，進(jìn)行田間栽培。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同菌液濃度對玉米抗性愈傷組織轉(zhuǎn)化率的影響

農(nóng)桿菌的生長時期不同，侵染能力有很大差別，農(nóng)桿菌濃度過高或過低都會影響其轉(zhuǎn)化率，本研究分別取OD600 nm為0.5、0.6和0.7用于轉(zhuǎn)化玉米GS01愈傷組織。結(jié)果表明，農(nóng)桿菌生長到對數(shù)中期時OD600 nm為0.6時具有最高的轉(zhuǎn)化率，在這個時期農(nóng)桿菌感染能力最強(qiáng)（表2）。

2.2 ?不同侵染時間對玉米抗性愈傷組織轉(zhuǎn)化率的影響

利用農(nóng)桿菌侵染不同玉米愈傷組織時，侵染時間的長短對其轉(zhuǎn)化率也有重要的影響。侵染時間過短，農(nóng)桿菌不能充分吸附在外植體上，從而降低了抗性愈傷組織轉(zhuǎn)化率;相反，若農(nóng)桿菌侵染時間過長，由于農(nóng)桿菌大量繁殖而造成抑菌困難則會使外植體褐化死亡，二者都會降低抗性愈傷組織轉(zhuǎn)化率。因此，對侵染時間進(jìn)行研究，確定最佳的侵染時間是十分必要的。本研究設(shè)定農(nóng)桿菌侵染時間分別為15、20和25 min。結(jié)果表明，侵染時間為20 min時具有最高的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)化率（表2）。

2.3 ?不同激素對玉米抗性愈傷組織分化及再生的影響

在A、B、C、D培養(yǎng)基中分別添加了不同濃度的6-BA、IBA和KT，研究不同激素單獨(dú)及配合使用對玉米幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)效果（表3）。由表3可看出，A、B、C和D 4種培養(yǎng)基對玉米幼胚愈傷組織的分化效果不同，其中B、C培養(yǎng)基上的分化率分別為17.6%和15.4%，再生率為9.6%和9.1%，即分化培養(yǎng)時，相同條件下，2.0 mg/L的6-BA比1.0 mg/L的KT效果好;A、D兩種培養(yǎng)基上的分化率和再生率分別為20.5%、19.4%和18.6%、14.5%，A培養(yǎng)基上的分化與再生效果要好于D培養(yǎng)基，即0.8 mg/L IBA與1.5 mg/L 6-BA配合使用對玉米抗性愈傷的分化和再生效果要好于加入1.0 mg/L KT和1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基;而A、D兩培養(yǎng)基上的分化率和再生率均高于B、C兩種培養(yǎng)基，說明不同種類和濃度的激素配合使用對抗性愈傷組織分化和再生的效果更好。

3 ?小結(jié)與討論

本試驗(yàn)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將phyA基因?qū)胗衩鬃越幌礕S01的胚性愈傷組織中，通過Bar基因的篩選標(biāo)記，使用除草劑進(jìn)行抗性愈傷的篩選，并優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化條件。結(jié)果表明，①當(dāng)菌液濃度OD600 nm為0.6時，抗性愈傷組織轉(zhuǎn)化率最高;②侵染時間20 min為愈傷組織的適宜侵染時間;③不同濃度的激素搭配使用有利于抗性愈傷組織的分化和再生。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織除了受基因型、愈傷組織狀態(tài)及菌種種類等因素影響外，農(nóng)桿菌菌液的濃度、侵染愈傷組織時間和添加不同的激素也會對其產(chǎn)生重要的影響。如果農(nóng)桿菌菌液濃度過低，那么就會導(dǎo)致農(nóng)桿菌附著于外植體傷口處的濃度低，以至于不能進(jìn)行充分轉(zhuǎn)化;而菌液濃度過高，那么農(nóng)桿菌生長已處于對數(shù)生長后期，侵染能力會下降，易導(dǎo)致在共培養(yǎng)時農(nóng)桿菌的過度增長，加大了對愈傷組織的損害，導(dǎo)致了外植體的褐化死亡。如果侵染時間過短，只有很少的農(nóng)桿菌吸附在外植體上，導(dǎo)致T-DNA不能有效轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不夠多，從而降低了抗性愈傷組織轉(zhuǎn)化率;相反，若農(nóng)桿菌侵染時間過長，農(nóng)桿菌會過度繁殖，最終導(dǎo)致農(nóng)桿菌的污染或因農(nóng)桿菌毒性過強(qiáng)而使外植體褐化死亡，二者都可以降低抗性愈傷組織轉(zhuǎn)化率[14-16]。培養(yǎng)基中添加不同種類和濃度的激素對抗性愈傷組織的分化與也起著重要的作用，在本試驗(yàn)設(shè)定條件下，6-BA對抗性愈傷組織分化及再生的效果比KT好，不同種類和濃度的激素配合使用對抗性愈傷組織分化和再生的效果好。

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