陸乘俊　孫超

摘要：目的 研究化療藥物對(duì)人肺細(xì)胞癌A549抑制基因Livin基因的影響。方法 將不同化療藥物濃度按100、50、25、12.5、6.25、、3.13、1.56、0.78ug/ml，與A549共同培養(yǎng)，分別作用24、48、72h，MTT檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果；real time PCR檢測(cè)Livin mRNA的表達(dá)，以及Western blots檢測(cè)Livin蛋白的變化。結(jié)果 不同濃度化療藥物與A549培養(yǎng)后，細(xì)胞凋亡率與化療的濃度增加而升高以及Livin基因的表達(dá)也明顯的改變（P<0.01）。結(jié)論 化療藥物通過(guò)抑制肺癌細(xì)胞A549 Livin基因表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：化療藥物；肺癌細(xì)胞；Livin基因

隨著吸煙人群的增加（包括吸入二手煙）及大氣污染的加重，肺惡性腫瘤的發(fā)病率逐年增加；治療目前除手術(shù)切除外，主要為化療與放療，但化療藥物的耐受性往往影響化療藥物的療效；目前研究發(fā)現(xiàn)Livin基因與腫瘤的耐受性有一定的關(guān)系[1，2]，因此，我們選用常見(jiàn)的化療藥物作用于肺癌細(xì)胞株，觀察Livin基因表達(dá)的改變，探討Livin基因與細(xì)胞凋亡的相互關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料 江蘇省無(wú)錫市人民醫(yī)院腫瘤科提供化療藥物依托鉑苷、卡鉑、多柔比星。中科院上海生化與細(xì)胞生物學(xué)研究所提供人肺癌細(xì)胞株（A549）。

1.2實(shí)驗(yàn)用儀器與試劑 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar， Denmark）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（NAPCO，USA）；倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，JAPAN）。DMEM培養(yǎng)基（GIBCO，USA）（每L含10%小牛血清、L-谷氨酰胺0.33mg，青霉素100U、鏈霉素100U、pH7.4）；胰蛋白酶（MERCK，USA）；二甲基亞砜（DMSO）（Merck，Germany），無(wú)水乙醇（分析純，上海振興化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20021200365）；Livin（abcam USA）、碘化丙啶（PI） （Sigma，USA），南京生物工程公司提供引物。

1.3 方法

1.3.1體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株 用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)、傳代人肺癌細(xì)胞株（A549）。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 正常對(duì)照組；依托鉑苷、卡鉑、多柔比星濃度按100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78ug/ml，與A549共同培養(yǎng)，分別作用24、48、72h。

1.3.3 MTT法檢測(cè)化療藥物對(duì)細(xì)胞活力的影響 使用0.25%胰酶消化培養(yǎng)至第3代的各組A549細(xì)胞后，吹制成單個(gè)細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度為1.0×104），分別接種到96孔板中（不含細(xì)胞的血清（為消除血清物質(zhì)對(duì)光吸收值的影響）（1～2列）、空白組細(xì)胞懸液（3～4列）；模型組細(xì)胞懸液（5～6列）；不同濃度的測(cè)試藥物組細(xì)胞懸液（7～12列）），于37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱放置并作用24h、48h、72h后，每孔再加入MTT溶液20ul，繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)。小心吸棄上清液，小孔加入DMSO 200μl溶解結(jié)晶物并振蕩10min后在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的吸光值。

1.3.4 RT-PCR 檢測(cè)Livin mRNA的表達(dá) 根據(jù)美國(guó)NCBI 的Genbank 提供的Livin 和β-actin mRNA 序列， 設(shè)計(jì)引物序列如下： ①LivinSense： 5′-TGAGGAGTTGCGTCTGGC-3′；Antisense： 5′-GGCTGCGTCTTCCGGTTC-3′。②β-actin（BC004251） Sense： 5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′； Antisense： 5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。PCR應(yīng)體系均為15ul，其中含cDNA模板2.5ul，SYBR Green 7.5ul，引物 0.6ul，去離子水4.4ul，95℃預(yù)變性5min，94 ℃45sec，56℃45sec，72 ℃50sec，35個(gè)循環(huán)；比較Ct法（△△Ct法）分析結(jié)果。

1.3.5蛋白印跡（Western blots） 分析 常規(guī)細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取、定量， SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后先后與5%BSA、一抗（濃度1∶1 000）、過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗（濃度1∶10 000） 孵育， 運(yùn)用ECF化學(xué)發(fā)光顯影、熒光圖像掃描儀掃描存入電腦。

1.4數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用SPSS13.5統(tǒng)計(jì)軟件，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1對(duì)A549細(xì)胞凋亡的改變 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，A549細(xì)胞經(jīng)化療藥物作用后，細(xì)胞的抑制明顯增高（P<0.01），并有劑量依賴(lài)性以及時(shí)間依賴(lài)性（見(jiàn)圖1～圖3）。

2.2各化療藥物組細(xì)胞Livin mRNA的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，化療藥物多柔比星、卡鉑與A549細(xì)胞分別作用24h、48h后，Livin 基因表達(dá)量呈逐漸下降趨勢(shì)， 且濃度越高， 時(shí)間越長(zhǎng)， 則表達(dá)量越少；72h后 Livin基因的表達(dá)量有增高趨勢(shì)；而依托鉑苷分別作用24、48、72h后， Livin 基因的表達(dá)量均呈逐漸下降趨勢(shì)， 且其幅度隨藥物濃度的增加而增加（圖4）。

2.3各化療藥物對(duì)A549細(xì)胞的Livin蛋白的影響 化療藥物采用IC50 的抑制濃度， 分別作用于A549細(xì)胞 24h、48h、72 h?；熕幬锒嗳岜刃?、卡鉑作用細(xì)胞24h、48h，Livin 蛋白表達(dá)量呈逐漸下降；72h Livin蛋白表達(dá)量有增高趨勢(shì)；依托鉑苷作用72 h 后， Livin 蛋白的表達(dá)均逐漸下降， 且其幅度隨藥物濃度的增加而增加（圖5）。

3討論

肺癌目前是全世界腫瘤死亡原因的第一位。近年來(lái)，認(rèn)識(shí)到大多數(shù)化療藥物是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖而實(shí)現(xiàn)治療作用。Livin 基因位于染色體20q13.3， 全長(zhǎng)46 kb， 包含7 個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子，它有兩種異構(gòu)體：Livinα 和Livinβ。Livin 基因在胎盤(pán)和發(fā)育中的組織以及黑色素瘤、白血病、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等一些腫瘤組織中特異性高表達(dá)， 而在大多數(shù)正常組織中不表達(dá)或僅有少量表達(dá)[3，4]，并且有研究認(rèn)為，癌癥患者放化療的耐藥與Livin基因的表達(dá)水平有關(guān)[5]。Livin基因可以通過(guò)抗死亡受體途徑、抗線(xiàn)粒體途徑和激活JNK1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡和抵抗腫瘤放化療作用[6]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A549經(jīng)化療藥物多柔比星、卡鉑作用后，Livin基因表達(dá)初期呈降低， 但隨化療藥物作用時(shí)間的增加，Livin基因表達(dá)呈明顯上升；Livin基因早期不僅通過(guò)與procaspase-9直接結(jié)合抑制其活性，還可以通過(guò)抑制caspase-3 的活性， 阻斷其對(duì)procaspase-9 的正反饋激活，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路；此外后期Livin基因作為一種酶抑制劑，通過(guò)BIR -結(jié)構(gòu)域結(jié)合凋亡過(guò)程中激活的核心物質(zhì)Caspases蛋白（如Caspase-3、Caspase-7 等）介導(dǎo)Caspases蛋白的失活和降解而發(fā)揮抗凋亡的作用；Livin基因表達(dá)規(guī)律與MTT檢測(cè)的細(xì)胞活力結(jié)果一致。依托鉑苷與Livin基因表達(dá)呈量效關(guān)系，作用效果優(yōu)于多柔比星及卡鉑，在臨床上可以減少腫瘤細(xì)胞的耐受性。

綜合上述，對(duì)于非小細(xì)胞肺癌，Livin基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡影響腫瘤的轉(zhuǎn)歸， 并可能為肺癌診斷和治療提供新的方向。

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編輯/申磊