鐘方麗， 楊 揚(yáng)，2， 王曉林*， 薛健飛， 張林林

(1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院， 吉林 吉林 132022; 2.吉林大學(xué) 化學(xué)學(xué)院， 長(zhǎng)春 130012)

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刺玫果提取物膠囊定性定量研究

鐘方麗1， 楊 揚(yáng)1，2， 王曉林1*， 薛健飛1， 張林林1

(1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院， 吉林 吉林 132022; 2.吉林大學(xué) 化學(xué)學(xué)院， 長(zhǎng)春 130012)

建立刺玫果提取物膠囊的定性鑒別和含量測(cè)定方法.采用薄層色譜法對(duì)刺玫果提取物膠囊進(jìn)行了定性分析；采用紫外-可見分光光度法，建立了刺玫果提取物膠囊總黃酮的含量測(cè)定方法；采用高效液相色譜法，建立了刺玫果提取物膠囊中金絲桃苷的含量測(cè)定方法.結(jié)果表明建立的薄層色譜鑒別方法，熒光斑點(diǎn)清晰，陰性無干擾；蘆丁在4.0～48.0 μg/mL (r=0.9996)，金絲桃苷在0.192～1.152 μg (r=0.9999)線性關(guān)系良好；蘆丁平均回收率100.05%，RSD為1.40% (n=6)；金絲桃苷平均回收率99.39%，RSD為0.66%(n=6).建立的薄層鑒別方法專屬性高，含量測(cè)定方法具有良好的精密度，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于刺玫果提取物膠囊的質(zhì)量控制.

刺玫果提取物； 膠囊； 含量； 金絲桃苷； 總黃酮

刺玫果提取物膠囊是由刺玫果經(jīng)提取、純化加工而成，具有理氣活血的作用，可用于治療冠心病、高脂血癥等.刺玫果藥材中所含的總黃酮類物質(zhì)具有防治高血脂和血栓所致的心腦血管疾病的功效[1-2]，為了控制該膠囊的質(zhì)量，本試驗(yàn)建立了膠囊中槲皮素的薄層鑒別，并采用UV、HPLC法分別建立了總黃酮和金絲桃苷的含量測(cè)定方法，從而為保證刺玫果提取物膠囊的活性效果提供了依據(jù).本文以蘆丁為對(duì)照品，采用UV法對(duì)刺玫果提取物膠囊中總黃酮的含量、采用HPLC法對(duì)刺玫果提取物膠囊中金絲桃苷的含量進(jìn)行了測(cè)定，并采用TLC法對(duì)刺玫果提取物膠囊中的槲皮素進(jìn)行了鑒別.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺玫果提取物膠囊(批號(hào)20140201、20140301、20140401、20140402、20140403)及陰性對(duì)照樣品為吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院藥學(xué)系自制.乙腈、四氫呋喃均為色譜純(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)；甲醇、冰乙酸為色譜純(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；水為重蒸餾水；其他化學(xué)試劑均為分析純；蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：100080-200707)，金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào)：111521-201004)，均為含量測(cè)定用，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院.

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；LC2030高效液相色譜儀(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；AEG-220電子天平(日本島津)；KQ-250B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ZF-20D暗箱式紫外分析儀(上海寶山顧村電光儀器廠).

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜鑒別

取重量差異項(xiàng)下的刺玫果提取物膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加60%乙醇適量，超聲使溶解，放冷并稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，作為供試品溶液.另精密稱取干燥至恒重的槲皮素對(duì)照品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，作為對(duì)照品溶液.另取淀粉等輔料制成的陰性膠囊2粒，按上述供試品溶液制備方法同法制成陰性對(duì)照溶液.照《中國(guó)藥典》2010 年版一部附錄Ⅵ B薄層色譜法試驗(yàn)[3-5]，吸取上述3批供試品溶液、槲皮素對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一層析硅膠(G)薄層板上，以醋酸乙酯-甲酸(8∶1)為展開劑，展開，取出，再晾干，以5%AlCl3乙醇溶液均勻噴灑，晾干，置于紫外分析儀(365 nm)下檢視，結(jié)果如圖1所示.在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯有相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照則無相應(yīng)的斑點(diǎn).

1、2、3-供試品；4-金絲桃苷；5-槲皮素；6-陰性對(duì)照

2.2 總黃酮含量測(cè)定

本品由刺玫果一味中藥經(jīng)提取純化而制成，具理氣活血之功效.刺玫果主要成份為黃酮類、多種三萜酸及沒食子酸甲酯等.黃酮類是主要活性成份，為此本文采用紫外-可見分光光度法測(cè)定樣品中總黃酮的含量[6].

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容，搖勻，配制成0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用.

2.2.2 供試品溶液的制備 取重量差異項(xiàng)下的本品約0.2 g，研細(xì)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加60%乙醇適量,超聲使其溶解，冷卻并稀釋至刻度，搖勻過濾，棄去初濾液，備用.

2.2.3 供試品溶液的制備方法的確定

1)提取溶劑的選擇 取重量差異項(xiàng)下的本品約0.2 g，研細(xì)，精密稱定，分別以30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇50 mL為溶媒，對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取10 min，分光光度法測(cè)定結(jié)果顯示：60%乙醇提取溶液吸光度值最大，所以選擇提取溶媒為60%乙醇.

2)提取時(shí)間的選擇 取重量差異項(xiàng)下的本品約0.2 g，研細(xì)，精密稱定，以50 mL 60%乙醇為溶媒，對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取5、10、15、20、25、30 min，分光光度法測(cè)定結(jié)果顯示：提取時(shí)間為15 min時(shí)吸光度值最大，所以將超聲時(shí)間確定為15 min.

3)提取溶劑用量的選擇 取重量差異項(xiàng)下的本品約0.2 g，研細(xì)，精密稱定，以 60%乙醇20、30、40、50 mL為溶媒，對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取15 min，分光光度法測(cè)定結(jié)果顯示：提取劑用量為50 mL，吸光度值最大，提取溶劑量確定為50 mL.

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加4%NaOH溶液10.0 mL，再加60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min.以未顯色的對(duì)照品溶液為空白，按照分光光度法，在505 nm處測(cè)定其吸光度，以吸收度為縱坐標(biāo)，蘆丁對(duì)照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7-8]，進(jìn)行直線回歸，回歸方程：Y=11.67X+0.0175，r=0.9996.結(jié)果表明:蘆丁在4.0～48.0 μg/mL呈良好線性關(guān)系.

2.2.5 精密度試驗(yàn) 吸取對(duì)照品溶液2.0 mL于25 mL容量瓶中，按2.2.4節(jié)的方法顯色，連續(xù)測(cè)定6次吸光度，RSD為0.50%，結(jié)果表明精密度較好.

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的刺玫果提取物膠囊內(nèi)容物0.2 g，精密稱定，按供試品溶液的配制方法制成溶液.在同一份供試品溶液中分別于配制后0、1、2、4、6、8、24 h進(jìn)行顯色，以供試品溶液為空白，在505 nm處測(cè)定吸光度值.經(jīng)計(jì)算可得RSD值為2.60%，結(jié)果表明供試品溶液顯色前24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.取上述的供試品溶液分別在顯色后0、5、10、15、20、25、30、35、40、60 min，在505 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值.經(jīng)計(jì)算可得RSD值為2.20%，結(jié)果表明供試品溶液顯色后60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好，滿足測(cè)定要求.

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)刺玫果提取物膠囊內(nèi)容物6份，各0.2 g，精密稱定，按2.2.2節(jié)的方法制成供試品溶液，吸取0.5 mL于25 mL容量瓶中，按2.2.4節(jié)方法顯色，在505 nm處測(cè)定吸光度值，RSD為0.28%，結(jié)果表明重復(fù)性良好.2.2.8加樣回收率試驗(yàn) 稱取6份總黃酮含量已知的刺玫果提取物膠囊內(nèi)容物，精密稱定，每份精密加入蘆丁對(duì)照品適量，按2.2.2節(jié)方法制備供試品溶液，按2.2.4項(xiàng)中方法顯色測(cè)定，結(jié)果見表1.結(jié)果表明回收率良好，方法準(zhǔn)確性較高，具有可行性.

表1 蘆丁加樣回收率試驗(yàn)

2.2.9 樣品含量測(cè)定 按上述膠囊總黃酮含量測(cè)定方法測(cè)定樣品含量，5批刺玫果提取物膠囊中每粒含總黃酮的結(jié)果分別為100.51、107.20、115.63、105.65、112.24 mg.

2.3 金絲桃苷含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的金絲桃苷對(duì)照品2.40 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.096 mg/mL金絲桃苷對(duì)照品溶液[9].

2.3.2 供試品溶液的制備 取重量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加60%乙醇適量，超聲10 min使溶解，放冷并稀釋至刻度，搖勻，過濾，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液.

2.3.3 供試品溶液的制備方法的確定

1)提取溶劑的選擇 取重量差異項(xiàng)下的本品約0.1 g，研細(xì)，精密稱定，置25 mL量瓶中，分別以30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇50 mL為溶媒，對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取10 min，微孔濾膜(0.45 μm)過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，金絲桃苷峰面積分別為996 67、164 449、123 056，結(jié)果顯示：60%乙醇作提取溶劑，相同條件下，峰面積更大，即含提取物質(zhì)含量最高.

2)提取時(shí)間的選擇 取本品膠囊內(nèi)容物約0.1 g，研細(xì)，精密稱定，置25 mL量瓶中，以 60%乙醇25 mL為溶媒，對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取5、10、15、20、25 min，微孔濾膜(0.45 μm) 過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，金絲桃苷峰面積分別為99 167、488 575、207 068、175 226、88 524，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超聲提取10 min，金絲桃苷含量更大.

3)提取溶劑用量的選擇 取重量差異項(xiàng)下的本品約0.1 g，研細(xì)，精密稱定，置25 mL量瓶中，以60%乙醇10、15、20、25、30 mL為溶媒，對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取10 min，微孔濾膜(0.45 μm) 過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，金絲桃苷峰面積分別為653 157、295 247、264 404、305 020、305 125，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明提取溶劑用量在25 mL時(shí)即可將金絲桃苷提取完全.

2.3.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取淀粉等輔料制成的陰性對(duì)照膠囊，按2.2.2節(jié)下方法制備陰性對(duì)照溶液.

2.3.5 色譜條件及適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱：伊利特C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-四氫呋喃-0.5%醋酸溶液(1∶1∶19∶79)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm[10]；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL.在此色譜條件下，金絲桃苷的保留時(shí)間為16.08 min，金絲桃苷與其他成分分離度大于1.5，理論塔板峰按金絲桃苷峰計(jì)算為3323，陰性對(duì)照在相應(yīng)的保留時(shí)間無吸收峰出現(xiàn).HPLC圖見圖2.

2.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加入60%乙醇定容至刻度，搖勻，制得系列對(duì)照品溶液.分別吸取20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以對(duì)照品溶液進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11-13]，回歸方程為：Y=3×106X-5.75×105，R=0.9999，結(jié)果表明金絲桃苷進(jìn)樣量在0.192～1.152 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的刺玫果總黃酮膠囊內(nèi)容物5份，每份各0.1 g，按上述方法制備5份供試品溶液，各進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行測(cè)定，金絲桃苷的峰面積RSD為1.17%，表明方法有良好的重復(fù)性.

2.3.8 儀器精密度試驗(yàn) 按上述色譜條件，精密吸取濃度為0.384 μg/mL的金絲桃苷對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，記錄金絲桃苷的峰面積，結(jié)果金絲桃苷的峰面積RSD為0.69%，結(jié)果表明精密度良好.

2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，室溫下放置，分別于1、2、3、4、5 h進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，結(jié)果金絲桃苷的峰面積RSD為0.95%，表明供試品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已知含量(1.35 mg/g)的樣品0.1 g，每份精密加入濃度為0.096 mg/mL金絲桃苷對(duì)照品溶液1.40 mL，按照上述方法制備供試品溶液，定容到10 mL容量瓶中，微孔濾膜過濾，按上述色譜條件各進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，計(jì)算回收率，金絲桃苷的平均回收率為99.39%，RSD為0.66%.結(jié)果見表2.

A.對(duì)照品溶液； B.供試品溶液； C.陰性溶液

表2 金絲桃苷加樣回收率試驗(yàn)

2.3.11 樣品含量測(cè)定 按上述膠囊金絲桃苷含量測(cè)定方法測(cè)定樣品含量，5批樣品中每粒含金絲桃苷測(cè)定結(jié)果分別為280.75、278.84、276.59、280.28、275.62 μg.

3 結(jié)論與討論

3.1 薄層色譜條件的選擇

3.1.1 展開劑的選擇 分別以醋酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)、苯-醋酸乙酯-甲酸(6∶4∶1)、氯仿-甲醇-水(28∶10∶1)、醋酸乙酯-甲酸(8∶1)為展開劑對(duì)展開系統(tǒng)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：醋酸乙酯-甲酸(8∶1)系統(tǒng)槲皮素Rf值適中，斑點(diǎn)分離效果好.

3.1.2 硅膠板的選擇 吸取供試品溶液3批、槲皮素對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照溶液，分別考察了自制硅膠G板(玻璃片基)、自制硅膠H板(玻璃片基)、層析硅膠(G)薄板(鋁箔片基)、層析硅膠(G)薄板(玻璃片基)的展開效果.結(jié)果表明，層析硅膠(G)薄板(鋁箔片基)展開效果良好，熒光斑點(diǎn)清晰.

3.1.3 顯色劑的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別選用5%AlCl3、9%FeCl3溶液為顯色劑，依前述方法顯色.結(jié)果顯示，均勻的噴灑5%AlCl3硅膠板上有明顯的熒光斑點(diǎn)；均勻的噴灑9%FeCl3溶液顯色劑顯色，硅膠板成黑色，熒光斑點(diǎn)不清晰.

3.1.4 供試品濃度及點(diǎn)樣量的選擇 分別稱取刺玫果提取物膠囊內(nèi)容物0.05、0.10、0.15 g，按供試品溶液的配制方法配制成不同濃度的供試品溶液，用微量注射器分別吸取2、3、5 μL供試品溶液樣于硅膠(G)薄層板.結(jié)果顯示稱取0.10 g膠囊內(nèi)容物配制的供試品溶液，點(diǎn)樣量為5 μL時(shí)，斑點(diǎn)清晰，Rf值適中，效果較好.

3.2 總結(jié)

本試驗(yàn)分別采用HPLC、UV法對(duì)刺玫果提取物膠囊中金絲桃苷、總黃酮的含量進(jìn)行了測(cè)定，并建立了刺玫果提取物膠囊中槲皮素的薄層鑒別方法.本試驗(yàn)建立的槲皮素薄層鑒別方法，斑點(diǎn)清晰，Rf值適中；建立的金絲桃苷含量測(cè)定方法專屬性強(qiáng)、陰性無干擾、線性關(guān)系良好，回收率、重現(xiàn)性符合要求；建立的總黃酮含量測(cè)定方法線性關(guān)系及回收率良好.上述方法可以作為刺玫果提取物膠囊的質(zhì)量控制方法.

[1] 鐘方麗， 陳 帥， 關(guān)曉俠. 微波法提取刺玫果總黃酮工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010(6):449-451．

[2] 王領(lǐng)弟， 李艷榮， 潘海峰， 等. 不同產(chǎn)地刺玫果中總黃酮含量的測(cè)定[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2012， 29(1):5-7．

[3] 魏 屹， 丁雪嬌， 包金穎. 高效液相色譜法測(cè)定余甘子藥材中槲皮素的含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2008， 19(7):1634-1635．

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典2010年版一部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2010:附錄34-35．

[5] 鐘方麗， 王曉林， 張 儉. 山玫片的薄層鑒別研究[J].吉林化工學(xué)院學(xué)報(bào)， 2007， 24(4):6-8．

[6] 俞作仁， 王文莉， 呂娟濤. 刺玫果化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥， 2002， 33( 2):188-190.

[7] 王隸書， 王海生， 高 軍， 等. 山刺玫不同藥用部位中總黃酮的含量測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2010， 16 (10):56-58．

[8] 任 靜， 李多偉， 王童文， 等. 超聲萃取蘋果渣中總黃酮工藝的研究[J].中成藥， 2003， 25(9):761-762．

[9] 傅善權(quán)， 鄭一敏， 楊艷紅， 等. 高效液相色譜法測(cè)定青果中金絲桃苷的含量[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2005， 17(增刊1): 67-68．

[10] 孫賀英， 付萍萍， 郝 娜. 反相高效液相色譜法測(cè)定照山白中金絲桃苷的含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2007， 18(10):2433-2434．

[11] 胡 偉， 陳飛虎， 吳繁榮， 等. HPLC 法測(cè)定鬼針草藥材中金絲桃苷的含量[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008， 43(6): 712-713．

[12] 鐘方麗， 王曉林， 敬采月. 高效液相色譜法測(cè)定刺玫果中金絲桃苷的含量[J].食品科學(xué)， 2010， 24(31):282-284．

[13] 趙艷普. HPLC測(cè)定照山白浸膏片中金絲桃苷的含量[J].中成藥， 2008， 30(3):456-457．

Study on the quality standard of the fruits extract ofRosadavuricaPall. capsule

ZHONG Fangli1， YANG Yang1，2， WANG Xiaolin1， XUE Jianfei1， ZHANG Linlin1

(1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering， Jilin Institute of Chemical Technology， Jilin，Jilin 132022;
2. School of Chemistry， Jilin University， Changchun 132022)

To establish the qualitative identification and content determination methods of the fruits extract ofRosadavuricaPall. capsule. TLC was used to accomplish the qualitative identification， while UV and HPLC were applied to determine the content of total flavonoids and hyperin of the fruits extract ofRosadavuricaPall. capsule respectively. There was no negative interference in established TLC method， which offered clear fluorescent spots. Rutin and hyperin showed good linear relationship at the range of 4.0～48.0 μg/mL (r=0.9996) and 0.192～1.152 μg (r=0.9999) respectively. The average recovery of rutin and hyperin were 100.05% and 99.39%， while theirRSDwere 1.40%(n=6) and 0.66% (n=6). TLC method obtained was specific and content determination methods were accurate and reliable， which could be applied for quality control of the fruits extract ofRosadavuricaPall. capsule．

fruits extract ofRosadavuricaPall.; capsule; content; hyperin; total flavonoids

2014-11-08.

吉林省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目(20110948).

1000-1190(2015)02-0228-05

R944

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: wangxiaolin69 @eyou.com.