丁 蘭， 陳祎平， 劉國(guó)安， 吳炎鵬

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 蘭州 730070)

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Wangzaozin A調(diào)節(jié)NADPH氧化酶源性活性氧誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化

丁 蘭*， 陳祎平， 劉國(guó)安， 吳炎鵬

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 蘭州 730070)

利用臺(tái)盼藍(lán)排染法、吉姆薩染色及流式細(xì)胞術(shù)對(duì)對(duì)映-貝殼杉烷二萜wangzaozin A影響人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60生長(zhǎng)、細(xì)胞形態(tài)、NBT還原能力、細(xì)胞吞噬及細(xì)胞表面抗原CD11b表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè).結(jié)果顯示，0.2～0.8 μmol/L wangzaozin A抑制HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)，0.6和0.8 μmol/L處理組細(xì)胞顯示了明顯的G1期周期阻滯.隨著wangzaozin A濃度升高及處理時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞核質(zhì)比減小，腎形核、桿狀核和分葉核細(xì)胞增多及胞質(zhì)中顆粒狀物質(zhì)增加；同時(shí)，細(xì)胞NBT還原能力、吞噬能力及細(xì)胞表面抗原CD11b表達(dá)顯著增強(qiáng)，表明wangzaozin A可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞分化.進(jìn)一步利用熒光探針DCF檢測(cè)顯示0.6和0.8 μmol/L wangzaozin A處理細(xì)胞12 h后細(xì)胞內(nèi)ROS顯著升高；抗氧化劑NAC及NADPH氧化酶抑制劑APO顯著抑制wangzaozin A誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞上調(diào)CD11b表達(dá)，表明wangzaozin A可通過(guò)上調(diào)NADPH氧化酶源性的活性氧濃度誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化.

wangzaozin A； HL-60細(xì)胞； 分化； 活性氧； NADPH氧化酶

急性髓性白血病(AML)主要源于細(xì)胞內(nèi)多種造血轉(zhuǎn)錄因子的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞分化受阻進(jìn)而發(fā)展成為癌癥[1].20世紀(jì)80年代，全反式維甲酸(ATRA)被成功用于急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL，為AML的一種亞型)的臨床分化治療[2]，維甲酸類化合物成為APL臨床分化治療最具代表性的分化誘導(dǎo)劑，其誘導(dǎo)分化機(jī)制成為腫瘤分化治療的前沿研究領(lǐng)域.研究證實(shí)，大多數(shù)APL具有特征性染色體t(15;17)易位，形成早幼粒細(xì)胞白血病基因和維甲酸受體α(RAR-α)基因的融合基因(PML-RARα)，該基因編碼的融合蛋白阻止APL細(xì)胞分化和凋亡[3-4]；ATRA和As2O3均能靶向作用于APL融合蛋白PML-RARα，使之降解，進(jìn)而誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化和凋亡[5-6].ATRA的分化治療及其與As2O3的聯(lián)合治療成為了APL治療的成功范例.然而，臨床治療所伴隨的ATRA綜合癥及耐藥性等問(wèn)題嚴(yán)重影響了分化治療的療效，因此，發(fā)現(xiàn)新的靶向分化誘導(dǎo)劑是解決耐藥性、毒副作用及提升療效的最佳途徑.

香茶菜屬植物的主要次生代謝產(chǎn)物對(duì)映-貝殼杉烷二萜已分離鑒定約500余種，其研究主要集中于植物化學(xué)成分及其分子結(jié)構(gòu)確定，有關(guān)生物活性的報(bào)道較少但逐年增多，其中良好的抗癌活性引起了極大關(guān)注[7-9]，某些對(duì)映-貝殼杉烷型二萜被認(rèn)為有望成為新的抗癌先導(dǎo)化合物[10].最近，該類化合物對(duì)不同類型的白血病細(xì)胞的靶向作用研究取得了重要進(jìn)展：腺花素(adenanthin)直接靶向作用于過(guò)氧化氧化還原蛋白Ⅰ和Ⅱ，抑制其活性，通過(guò)升高急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞NB4細(xì)胞活性氧濃度，激活相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化[11]，并顯示了對(duì)不同類型的白血病細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用[12]；川藏香茶菜甲素(pharicin A)可直接與紡錘體組裝檢點(diǎn)蛋白BubR1結(jié)合，干擾BubR1功能，誘導(dǎo)白血病Jurkat和Raji細(xì)胞阻滯于M期[13]；川藏香茶菜乙素(pharicin B)能迅速穩(wěn)定多種AML細(xì)胞內(nèi)的RAR-α蛋白，顯著增強(qiáng)ATRA的分化誘導(dǎo)作用[14]；冬凌草甲素(oridonin)可與致癌蛋白AML1-ETO結(jié)合，使其產(chǎn)生截短的AML1-ETO，選擇性地誘導(dǎo)t(8;21)白血病細(xì)胞凋亡[15].這些研究結(jié)果表明，不同分子骨架的對(duì)映-貝殼杉烷型二萜可多靶點(diǎn)作用于白血病細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化及凋亡，契合了中醫(yī)學(xué)的“多靶點(diǎn)效應(yīng)”，充分顯示了該類化合物對(duì)白血病分化治療的潛在價(jià)值.然而迄今為止，對(duì)不同分子構(gòu)型的對(duì)映-貝殼杉烷二萜的分化誘導(dǎo)機(jī)制的研究還極少.本課題組對(duì)一種C-20位未氧化型對(duì)映-貝殼杉烷二萜wangzaozin A在分子結(jié)構(gòu)確定，細(xì)胞毒性的構(gòu)效關(guān)系，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及凋亡誘導(dǎo)方面進(jìn)行了系統(tǒng)的研究[9,16-19]，發(fā)現(xiàn)wangzaozin A在較高濃度下(3.0～4.0 μmol/L)可損傷HL-60細(xì)胞DNA，使細(xì)胞大量細(xì)滯于S期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9].本文首次報(bào)道wangzaozin A在低濃度下(0.4～0.8 μmol/L)影響HL-60細(xì)胞NADPH氧化酶，上調(diào)細(xì)胞活性氧水平，進(jìn)一步誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞分化，證明了wangzaozin A具有與已報(bào)道的對(duì)映-貝殼杉烷二萜具有完全不同的作用靶點(diǎn).而且不同濃度wangzaozin A可誘導(dǎo)完全不同的細(xì)胞應(yīng)答，產(chǎn)生不同的活性效應(yīng)，這對(duì)于該類化合物的抗白血病機(jī)制深入研究以及發(fā)展新型分化誘導(dǎo)劑具有重要價(jià)值.關(guān)于NADPH氧化酶介導(dǎo)天然有機(jī)小分子誘導(dǎo)細(xì)胞分化的報(bào)道還很少，本研究也為天然分化誘導(dǎo)劑的篩選與研究提供新思路.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Merck公司；臺(tái)盼藍(lán)、碘化丙啶(PI)、硝基四氮唑藍(lán)(nitrotetrazolium blue chloride，NBT)、佛波酯 (phorbol esters，TPA)、夾竹桃麻素(apocynin，APO)、吉姆薩均為Sigma公司產(chǎn)品；RNase A購(gòu)自北京 Solarbio公司；活性氧檢測(cè)熒光探針DCFH-DA (2′，7′-dichlorfluoresceindiacetate)、抗氧化劑NAC (N-acetylcysteine)購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD11b單抗，購(gòu)自德國(guó)Biosciences公司；吞噬熒光探針P(HPMA-FMA)由本實(shí)驗(yàn)室合成[20]；其他化學(xué)藥品為國(guó)產(chǎn)分析純.

對(duì)映-貝殼杉烷型二萜化合物wangzaozin A由本實(shí)驗(yàn)室從甘肅產(chǎn)總序香茶菜(Isodonracemosa(Hemsl) Hara)中分離得到，并采用現(xiàn)代波譜學(xué)方法(紫外、紅外、質(zhì)譜、核磁共振和X-單晶衍射)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確定，為純度99.5%以上的單體化合物[16]，使用前用DMSO配制成20 mmol/L母液儲(chǔ)存于4℃冰箱.其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示.

圖1 Wangzaozin A化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of wangzaozin A

CO2培養(yǎng)箱(美國(guó) Forma Scientific)、超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)，江蘇)、倒置顯微鏡(Leitz-diavert)、正置熒光顯微鏡(Leica DMI4000B，德國(guó))、流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter Cell Lab Quanta SC Flow Cytometer，美國(guó))、高速低溫離心機(jī)(BeckmanCoulter Allegra64R，美國(guó)).

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60引自蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院.細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中(含100 U/mL青霉素與100 μg/mL鏈霉素)，置于37℃，5% CO2飽和濕度恒溫箱中培養(yǎng).

1.3 臺(tái)盼藍(lán)排染法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)與存活

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞懸液，以濃度為2×104個(gè)/mL接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔300 μL，于37℃預(yù)培養(yǎng)24 h，分別加入受試藥物wangzaozin A(0、0.2、0.4、0.6和0.8 μmol/L)及ATRA(2 μmol/L).每隔24 h收集細(xì)胞，取0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以1∶4與細(xì)胞懸液充分混勻，染色3～5 min 后吸取適量混合液，用血球計(jì)數(shù)板在光鏡下活細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，活細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪圖.所有實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)重復(fù).

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布

將濃度為2×104個(gè)/mL的HL-60細(xì)胞懸液以每孔3 mL接種于6孔板，預(yù)培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的wangzaozin A(0～0.8 μmol/L)或ATRA(2 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h和72 h后，1000 r/min離心5 min，棄上清液，預(yù)冷的PBS洗2次，加入70%乙醇，在-20℃下固定過(guò)夜.1 000 r/min離心5 min，棄去乙醇后用PBS洗2次，加入RNase A，終濃度為100 μg/mL，37℃孵育30 min后，再加入PI(碘化丙啶)，終濃度為40 μg/mL，避光孵育30 min后，260目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè).

1.5 吉姆薩染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化

細(xì)胞接種濃度及藥物處理如1.4.離心收集藥物處理72 h后的細(xì)胞，PBS洗2次后用甲醇-冰乙酸(3∶1)固定30 min，鋪片，晾干后用PBS配制的Gimesa工作液染色20 min，用蒸餾水沖洗干凈，于顯微鏡下觀察拍照.

1.6 細(xì)胞NBT還原能力測(cè)定

細(xì)胞接種濃度及藥物處理如1.4.離心收集藥物處理72 h后的細(xì)胞，PBS洗2次.將待測(cè)細(xì)胞以106/mL密度重懸于PBS (含2 mg/mL NBT和200 ng/mL TPA)中，37 ℃孵育30 min，離心去上清，涂片，光鏡下觀察胞漿內(nèi)含灰藍(lán)色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞.計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，計(jì)算NBT陽(yáng)性細(xì)胞率.

細(xì)胞接種濃度及藥物處理如1.4.待藥物處理72 h后加入熒光探針P(HPMA-FMA)[20]，使其每孔終濃度為30 μg/mL，繼續(xù)孵育3 h，離心收集細(xì)胞，PBS洗2次，加入1 mL的PBS混勻，吸取500 μL細(xì)胞懸液涂片，于熒光顯微鏡下觀察拍照，其余500 μL用于流式細(xì)胞儀檢測(cè).

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HL-60細(xì)胞表面抗原CD11b表達(dá)

細(xì)胞接種濃度及藥物處理如1.4.離心收集藥物處理72 h后的細(xì)胞，PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL，取500 μL細(xì)胞懸液加入5 μL的 FITC-CD11b，避光靜置孵育30 min，PBS洗1次，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞CD11b表達(dá).

1.9 DCFH-DA單染色法檢測(cè)HL-60 細(xì)胞ROS水平

細(xì)胞接種濃度及藥物處理如1.4.藥物處理12 h、24 h后，離心收集細(xì)胞，PBS 洗2次.每個(gè)樣品加入DCFH-DA (10 μmol/L) 熒光探針，37℃孵育30 min，每隔5 min搖勻一次，PBS洗2次，去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的 DCFH-DA，上流式細(xì)胞儀檢測(cè).

1.10 NAC聯(lián)合wangzaozin A影響HL-60 細(xì)胞CD11b表達(dá)的測(cè)定

將濃度為2×104個(gè)/mL的HL-60 細(xì)胞懸液以每孔3 mL接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為0.6 μmol/L wangzaozin A或0.5 mmol/L NAC或0.6 μmol/L wangzaozin A+0.5 mmol/L NAC，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞，PBS洗2次后調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL，每500 μL細(xì)胞懸液加FITC-CD11b抗體 5 μL，避光孵育30 min，PBS洗1次，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11b表達(dá).

1.11 APO聯(lián)合wangzaozin A影響HL-60 細(xì)胞CD11b表達(dá)的測(cè)定

a) 在PLC梯形圖程序設(shè)計(jì)軟件里，需做如下設(shè)置：打開系統(tǒng)塊設(shè)置窗口→通信端口設(shè)置→PLC地址：2→最高地址：31→波特率：19.2 kbps。將程序重新下載至PLC中。

將HL-60細(xì)胞以2×104/mL接種至6孔板，每孔3 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為0.6 μmol/L wangzaozin A或0.4 mmol/L APO或0.4 mmol/L APO+0.6 μmol/L wangzaozin A，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞，1000 r/min離心5min，棄上清，加PBS洗2次后調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL，每毫升細(xì)胞懸液加入FITC-CD11b 抗體5 μL，避光孵育30 min，PBS洗1次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11b表達(dá).

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析:實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用x±SD表示(n=3)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組用t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Wangzaozin A對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

不同濃度的wangzaozin A 處理HL-60細(xì)胞24 h、48 h、72 h和96 h后，用臺(tái)盼藍(lán)排染法檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)，結(jié)果如圖2所示.與對(duì)照相比，wangzaozin A(0.2～0.8 μmol/L)在96 h內(nèi)對(duì)HL-60細(xì)胞顯示了生長(zhǎng)抑制作用，并具有劑量和時(shí)間依賴效應(yīng).對(duì)照組細(xì)胞在培養(yǎng)96 h之后由于細(xì)胞數(shù)量過(guò)多，受培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)限制出現(xiàn)部分死亡，而所有處理組細(xì)胞的存活率均大于97%.2 μmol/L ATRA處理組在48 h內(nèi)與0.4 μmol/L wangzaozin A的抑制活性相當(dāng)，培養(yǎng)72 h后其抑制活性處于0.4～0.6 μmol/L wangzaozin A之間.

圖2 Wangzaozin A對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用Fig.2 The growth inhibition of wangzaozin A on HL-60 cells

流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，0.2～0.8 μmol/L的wangzaozin A處理HL-60細(xì)胞48 h和72 h后G1期細(xì)胞增多，0.6～0.8 μmol/L處理組呈現(xiàn)明顯的G1期阻滯；72 h處理組G1期阻滯率高于48 h處理組，同時(shí)顯示了相應(yīng)的劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)(見(jiàn)圖3).

圖3 Wangzaozin A引起HL-60細(xì)胞周期阻滯Fig.3 The cycle arrest of HL-60 cells caused by wangzaozin A

2.2 Wangzaozin A誘導(dǎo)HL-60 細(xì)胞分化

2.2.1 細(xì)胞形態(tài)變化提示細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞分化

0.2～0 .8 μmol/L wangzaozin A處理HL-60細(xì)胞72 h后經(jīng)吉姆薩染色顯示，對(duì)照組細(xì)胞的核大，多為近圓形，核質(zhì)比高，核仁清晰；經(jīng)wangzaozin A處理后，細(xì)胞核形不規(guī)則，呈現(xiàn)出腎形核(圖4紅色箭頭)、桿狀核(圖4綠色箭頭)和分葉核(圖4藍(lán)色箭頭)細(xì)胞，并且細(xì)胞核質(zhì)比減小，胞質(zhì)中顆粒狀物質(zhì)增加，與ATRA處理組細(xì)胞的變化相似.隨著wangzaozin A濃度的升高，腎形核、桿狀核和分葉核細(xì)胞數(shù)量增加，提示細(xì)胞趨向成熟粒細(xì)胞分化(見(jiàn)圖4).

A：對(duì)照.B:0.2 μmol/L wangzaozin A.C:0.4 μmol/L wangzaozin A.D:0.6 μmol/L wangzaozin A．E:0.8 μmol/L wangzaozin A.F:2.0 μmol/L ATRA (×400)．

2.2.2 Wangzaozin A增強(qiáng)細(xì)胞NBT還原能力 Wangzaozin A對(duì)HL-60細(xì)胞的NBT還原能力的影響如圖5所示.不同濃度的wangzaozin A均可增加細(xì)胞內(nèi)甲臜的沉淀及細(xì)胞著色，并隨著藥物濃度增加細(xì)胞著色加深，陽(yáng)性細(xì)胞率增加.0.4 μmol/L藥物處理組與對(duì)照組比，具有顯著性差異(P<0.05)；0.6 μmol/L wangzaozin A處理組的陽(yáng)性細(xì)胞率與2 μmol/L ATRA處理組相近，提高3倍多;0.8 μmol/L 處理組的陽(yáng)性細(xì)胞率提高約4.5倍，與對(duì)照組比這3組均達(dá)到極顯著差異(P<0.01).

2.2.3 Wangzaozin A增強(qiáng)HL-60細(xì)胞吞噬能力

對(duì)顆粒性異物的吞噬性是粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的特性之一，可作為細(xì)胞分化程度的特征標(biāo)志.P(HPMA-FMA)為本實(shí)驗(yàn)室合成的高分子熒光探針[20]，與細(xì)胞孵育后可通過(guò)熒光強(qiáng)度變化確定培養(yǎng)細(xì)胞的吞噬特性.利用熒光顯微鏡可視化檢測(cè)HL-60細(xì)胞對(duì)高分子熒光顆粒物質(zhì)P(HPMA-FMA)的吞噬活性，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞有較弱的顆粒吞噬能力，而經(jīng)wangzaozin A處理HL-60細(xì)胞72 h后，處理組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度均有增強(qiáng)，表明細(xì)胞對(duì)熒光顆粒的吞噬能力增強(qiáng)，其中0.6 μmol/L wangzaozin A處理組與2.0 μmol/L ATRA處理組熒光強(qiáng)度相當(dāng)(見(jiàn)圖6 A).流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明wangzaozin A可顯著增加HL-60細(xì)胞吞噬能力.與對(duì)照組相比，0.2 μmol/L、 0.4 μmol/L、0.6 μmol/L和0.8 μmol/L wangzaozin A處理組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分別增加了126±7 %、141±10.5 %、163±8.8%和183±9%，并顯示了濃度依賴性.ATRA處理組的增加率為159%，與0.6 μmol/L 處理組接近(見(jiàn)圖6 B).

A：顯示不同濃度wangzaozin A及ATRA處理HL-60 細(xì)胞72 h后細(xì)胞著色變化 (×400). a：對(duì)照組.b:0.2 μmol/L wangzaozin A.c:0.4 μmol/L wangzaozin A.d:0.6 μmol/L wangzaozin A.e:0.8 μmol/L wangzaozin A.f:2.0 μmol/L ATRA.B：不同濃度wangzaozin A及ATRA處理HL-60 細(xì)胞72 h后NBT陽(yáng)性細(xì)胞率．

A： 0.6 μmol/L wangzaozin A和2.0 μmol/L ATRA處理HL-60細(xì)胞72 h后細(xì)胞吞噬P(HPMA-FMA)的熒光顯微鏡圖像(×400).B： 藥物處理HL-60細(xì)胞72 h后，細(xì)胞吞噬納米熒光顆粒P(HPMA-FMA)的能力．

2.2.4 Wangzaozin A上調(diào)HL-60細(xì)胞表面抗原CD11b的表達(dá) 在血細(xì)胞的分化過(guò)程中CDllb被認(rèn)為在原始粒細(xì)胞上基本不表達(dá)，隨著細(xì)胞的成熟分化，CDllb表達(dá)逐漸升高，因而可作為細(xì)胞分化程度的檢測(cè)指標(biāo).不同濃度的wangzaozin A和ATRA處理HL-60細(xì)胞72 h后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其細(xì)胞表面CD11b蛋白表達(dá)量.如圖7所示， 與對(duì)照組相比，0.4～0.8 μmol/L處理組細(xì)胞CD11b的表達(dá)顯著上升，均達(dá)到極顯著水平.ATRA處理組細(xì)胞CD11b表達(dá)量略高于0.6 μmol/L處理組.

圖7 Wangzaozin A及ATRA處理HL-60細(xì)胞72 h后對(duì)細(xì)胞CD11b表達(dá)的影響Fig.7 The effects of wangzaozin A and ATRA on the expression of CD11b of HL-60 cells

2.3 活性氧介導(dǎo)wangzaozin A對(duì)HL-60細(xì)胞的分化誘導(dǎo)

2.3.1 Wangzaozin A上調(diào)HL-60細(xì)胞ROS濃度 為了探討ROS是否參與化合物誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的分化，利用ROS熒光探針DCF及流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的ROS進(jìn)行檢測(cè).不同濃度的wangzaozin A及2.0 μmol/L的ATRA處理HL-60細(xì)胞12 h和24 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化結(jié)果如圖8所示.0.6 μmol/L及0.8 μmol/L的wangzaozin A處理細(xì)胞12 h后能引起細(xì)胞內(nèi)ROS的升高，并具有顯著性差異，但24 h處理組ROS濃度變化不明顯；ATRA處理組與0.6 μmol/L wangzaozin A處理組的結(jié)果相似，升高細(xì)胞內(nèi)ROS濃度，與對(duì)照相比具有顯著性差異.

圖8 Wangzaozin A和ATRA處理HL-60 細(xì)胞12h或24 h后細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的變化Fig.8 The change of ROS in HL-60 cells after treatments with wangzaozin A and ATRA for12h or 24 h

2.3.2 NAC抑制wangzaozin A對(duì)HL-60細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用 為了檢測(cè)wangzaozin A誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的分化是否是與活性氧信號(hào)相關(guān)聯(lián)，我們將抗氧化劑NAC(0.5 mmol/L)與wangzaozin A(0.6 μmol/L)聯(lián)合處理細(xì)胞72 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD11b表達(dá)情況，判斷聯(lián)合作用下NAC對(duì)wangzaozin A誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化的影響.如圖9所示，0.6 μmol/L wangzaozin A處理HL-60細(xì)胞72 h后可顯著升高細(xì)胞CD11b表達(dá)，與對(duì)照組相比，達(dá)到極顯著差異(P<0.01).0.5 mmol/L的NAC單獨(dú)處理HL-60細(xì)胞72 h后對(duì)細(xì)胞CD11b表達(dá)水平無(wú)影響；當(dāng)0.6 μmol/L wangzaozin A與NAC聯(lián)合處理HL-60細(xì)胞72 h后，與0.6 μmol/L wangzaozin A組相比，細(xì)胞CD11b表達(dá)顯著下降，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，表明抗氧化劑NAC降低或消除細(xì)胞活性氧后對(duì)wangzaozin A誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞分化具有明顯的抑制效應(yīng)，說(shuō)明活性氧介導(dǎo)了wangzaozin A誘導(dǎo)的分化作用.

2.3.3 APO抑制wangzaozin A對(duì)HL-60細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用 APO可抑制細(xì)胞質(zhì)膜NADPH氧化酶活性，減弱或消除由NADPH氧化酶所產(chǎn)生的活性氧.APO與wangzaozin A的聯(lián)合使用可判斷誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化的活性氧信號(hào)來(lái)源是否與NADPH氧化酶相關(guān)聯(lián).從圖10可以看出，APO聯(lián)合wangzaozin A處理組與wangzaozin A單獨(dú)處理組相比，HL-60細(xì)胞的CD11b表達(dá)顯著下降，僅為單獨(dú)處理組的63.2%.表明APO對(duì)NADPH氧化酶活性的抑制介導(dǎo)了wangzaozin A對(duì)HL-60細(xì)胞分化的誘導(dǎo).

圖9 NAC對(duì)wangzaozin A誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞表達(dá)CD11b的影響Fig.9 The effect of NAC on the expression of CD11b in HL-60 caused by wangzaozin A

圖10 APO對(duì)wangzaozin A誘導(dǎo)HL-60 細(xì)胞表達(dá)的影響Fig.10 The effect of APO on the expression of CD11b in HL-60 caused by wangzaozin A

3 討論

香茶菜屬植物冬凌草作為抗炎及抗癌的藥物已臨床使用多年，其有效成分冬凌草甲素(oridonin)具有靶向作用于癌蛋白AML1-ETO進(jìn)一步誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的作用[15]，該化合物已有白血病臨床試驗(yàn)訊息.最近，另一種對(duì)映-貝殼杉烷二萜腺花素(adenanthin)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化及其靶向作用PxⅠ/Ⅱ的機(jī)制為該類化合物抗白血病研究提供了新途徑[11].

細(xì)胞增殖受阻及細(xì)胞周期的停滯是細(xì)胞分化的重要特征[21].研究顯示， wangzaozin A 在0.2～0.8 μmol/L時(shí)顯著抑制HL-60細(xì)胞增殖，延緩細(xì)胞周期進(jìn)程，引起G1周期阻滯，但對(duì)其存活無(wú)影響，這與該化合物在完全生長(zhǎng)抑制濃度下(3.0～4.0 μmol/L)處理36 h后引起S期阻滯及大量細(xì)胞凋亡完全不同[9]，顯示了該化合物在不同劑量及處理時(shí)間誘導(dǎo)了不同的細(xì)胞應(yīng)答信號(hào)途徑.綜合分析wangzaozin A處理HL-60細(xì)胞后其細(xì)胞形態(tài)、NBT還原能力、細(xì)胞吞噬能力及細(xì)胞表面黏著因子CD11b表達(dá)的變化，圖片及測(cè)試數(shù)據(jù)均顯示wangzaozin A誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞分化.經(jīng)0.4～0.8 μmol/L wangzaozin A處理HL-60細(xì)胞72 h后腎形核細(xì)胞明顯增多，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)其桿狀核和分葉核細(xì)胞逐漸增多，且吞噬性增強(qiáng)，這些特征是粒細(xì)胞成熟最顯著的細(xì)胞學(xué)標(biāo)志[22-23]，其分子標(biāo)記CD11b在處理組細(xì)胞表達(dá)升高的證據(jù)進(jìn)一步支持了wangzaozin A可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞分化的判斷[24].Wangzaozin A誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化的模式與全反式維甲酸及DMSO誘導(dǎo)分化模式相類似[25-26].

研究證實(shí)，ROS作為胞內(nèi)信號(hào)分子參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等多種信號(hào)途徑的調(diào)控[27]，并且ROS在干細(xì)胞或祖細(xì)胞的分化過(guò)程中是一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[28].細(xì)胞內(nèi)ROS有多種來(lái)源，包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase)、線粒體呼吸鏈、黃嘌呤氧化酶以及環(huán)氧合酶等，而在受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起作用的ROS主要源于NADPH氧化酶，通過(guò)其活性精確調(diào)節(jié)控制細(xì)胞內(nèi)ROS水平[29-30].目前已證實(shí)，NADPH氧化酶源性的ROS可通過(guò)p38 MAPK途徑激活心肌基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[31-32]，為心肌干細(xì)胞移植治療心肌梗塞提供了新的研究靶點(diǎn).Chen[33]證實(shí)黃酮化合物異甘草素(Isoliquiritigenin)在翻譯和轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)NADPH氧化酶的gp91phox 和p47 phox亞基表達(dá)，提高ROS水平，誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向單核細(xì)胞分化.外源H2O2也可影響NADPH氧化酶，升高ROS濃度，誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化[34].本文中wangzaozin A處理HL-60細(xì)胞12 h后細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度顯著升高，在該處理組中加入活性氧清除劑NAC后HL-60細(xì)胞CD11b表達(dá)下調(diào)，明顯減弱wangzaozin A對(duì)HL-60細(xì)胞CD11b表達(dá)的上調(diào)誘導(dǎo)，表明ROS介導(dǎo)了wangzaozin A對(duì)HL-60細(xì)胞的分化作用；NADPH氧化酶抑制劑APO也可減弱wangzaozin A誘導(dǎo)的分化作用，進(jìn)一步揭示wangzaozin A誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞分化是通過(guò)NADPH氧化酶對(duì)活性氧生成的調(diào)控，即wangzaozin A可能通過(guò)激活HL-60細(xì)胞NADPH氧化酶，上調(diào)ROS濃度，調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化.

本研究提示NADPH氧化酶是干預(yù)HL-60細(xì)胞分化的重要因子，而Liu[11]報(bào)道另一種對(duì)映-貝殼杉烷二萜腺花素(adenanthin)可靶向作用另一種早幼粒白血病細(xì)胞NB4的過(guò)氧化還原酶Ⅰ/Ⅱ，抑制其對(duì)ROS的清除作用，誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化，顯示了相似分子構(gòu)型的對(duì)映-貝殼杉烷二萜可通過(guò)兩種不同途徑影響細(xì)胞內(nèi)ROS水平.另外，沒(méi)有證據(jù)顯示adenanthin誘導(dǎo)的分化作用與NADPH氧化酶無(wú)關(guān)，或者wangzaozin A不能影響過(guò)氧化還原酶系統(tǒng)，但兩個(gè)實(shí)驗(yàn)體系的證據(jù)均將其分化信號(hào)指向了活性氧水平的升高.從理論上講，進(jìn)入細(xì)胞的化合物可與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)相互作用，其親和性及作用部位不同，對(duì)不同蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生不同影響.重要的是，細(xì)胞針對(duì)不同信號(hào)刺激，整合信號(hào)通路進(jìn)行應(yīng)答反應(yīng).盡管我們的結(jié)論尚需在分子水平進(jìn)一步證實(shí)wangzaozin A影響NADPH氧化酶功能的機(jī)制，但已有的證據(jù)提示wangzaozin A具有抗白血病的潛在價(jià)值.

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Wangzaozin A regulates NADPH oxidase-derived reactive oxygen species to induce the differentiation of HL-60 cells

DING Lan， CHEN Yiping， LIU Guoan， WU Yanpeng

(College of Life Sciences， Northwest Normal University， Lanzhou 730070)

The effects of wangzaozin A， a kind ofent-kaurane diterpenoids， on the growth， cellular morphology， NBT-reducing ability， cellular uptake and cell surface markers CD11b of HL-60 cells were determined by trypan blue exclusion method， giemsa stainning and flow cytometry. The results showed that 0.2～0.8 μmol/L wangzaozin A could inhibit the growth of HL-60 cells， cells treated with 0.6 and 0.8 μmol/L wangzaozin A presented obviously G1 arrest. With the increase of the concentration of wangzaozin A and the treatment time， metamyelocytes， banded neutrophils and segmented neutrophils increased， nuclear/cytoplasm ratio decreased， granular substance in cells increased; at the same， NBT-reducing ability， cellular uptake and the expression of CD11b of HL-60 cells enhanced remarkedly， with a obvious dose-and time-dependent manner. The results showed that differentiation of human HL-60 cells into granulocyte could be induced by wangzaozin A. Further， the detection by fluorescence probe DCF showed that ROS in cells treated with 0.6 and 0.8 μM wangzaozin A after 12 h increased obviously; the expression of CD11b induced by wangzaozin A could be markedly inhibited by antioxidant NAC and APO which is the inhibitor of NADPH oxidas. It indicated that wangzaozin A could induce the differentiation of HL-60 cells by up-regulating concentration of NADPH oxidase-derived reactive oxygen species．

wangzaozin A; HL-60 cells; differentiation; ROS; NADPH oxidase

2014-12-01.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30960464).

1000-1190(2015)02-0252-09

Q28

A

*E-mail: dinglan@nwnu.edu.cn.