戚應(yīng)杰，岳 莉，朱義媛，劉 楊，石玉如

（安徽省合肥市傳染病醫(yī)院檢驗科，合肥 230022）

·臨床研究·

乙型肝炎病毒耐藥基因變異位點與基因型及病毒載量的關(guān)系

戚應(yīng)杰，岳 莉，朱義媛，劉 楊，石玉如

（安徽省合肥市傳染病醫(yī)院檢驗科，合肥 230022）

目的研究81例慢乙型肝炎患者乙型肝炎病毒（HBV）耐藥基因位點變異狀況及其基因型分布特征，并探討其與HBV－DNA、乙型肝炎E抗原（HBeAg）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的關(guān)系。方法采用熒光定量PCR和基因芯片反向斑點雜交技術(shù)檢測81例慢乙型肝炎患者血清HBV－DNA載量、基因型和6種常見耐藥位點；用電化學(xué)發(fā)光法檢測HBeAg的含量，用酶法檢測患者血清中ALT、AST的濃度。結(jié)果81例慢乙型肝炎患者中，HBV基因型B型38例占46.9%；C型38例占46.9%；B、C混合型5例占6.2%；未發(fā)現(xiàn)其他基因型。檢測出的43例耐藥基因位點發(fā)生變異：B基因型26例突變率為60.5%，C基因型17例突變率為39.5%；其中rt204V變異率為9.3%；rt204I變異率為34.9%；rt180M＋rt204I/rt204V變異率為41.9%；rt181V變異率為9.3%；rt236T變異率為4.7%。在43例出現(xiàn)基因位點變異的患者中，發(fā)生rt204I變異的B基因型占60%，HBV－DNA（U/mL）的對數(shù)值為5.73±1.77；C基因型占40%，HBV－DNA（U/mL）的對數(shù)值為6.93±2.12；發(fā)生rt204V變異的B基因型占75%，HBV－DNA（U/mL）的對數(shù)值為6.85±2.06；C基因型占25%，HBV－DNA（U/mL）的對數(shù)值為4.17±1.15；發(fā)生rt180M＋rt204I/rt204V變異的B基因型占22.2%，HBV－DNA（U/mL）的對數(shù)值為5.89±1.95；C基因型占77.8%，HBV－DNA（U/mL）的對數(shù)值為5.58±1.56；發(fā)生rt181V變異的全部為C基因型。結(jié)論HBV發(fā)生變異的位點以rt204I位點變異和rt180M＋rt204I/rt204V混合位點變異為主；在HBV發(fā)生變異的不同位點中C基因型更易發(fā)生rt181V位點和rt180M＋rt204I/rt204V混合位點變異，B基因型可能更易發(fā)生rt204V位點和rt204I位點變異；在發(fā)生rt204V位點和rt236T位點的突變中，HBV－DNA的載量B基因型組明顯高于C基因型組，在發(fā)生rt204I位點的突變中HBV－DNA的載量C基因型組則明顯高于B基因型組，C基因型較B基因型更易發(fā)生耐藥位點變異。

慢性乙型肝炎； 基因型； 耐藥基因位點； DNA檢測； 乙型肝炎E抗原

乙型肝炎病毒（HBV）是一種嗜肝DNA病毒，主要引起急、慢性肝炎，肝硬化和肝癌等。如果病情反復(fù)活動或持續(xù)進展，則需要及時給予抗病毒治療［1］。HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正閱讀功能，HBV的變異率較其他DNA病毒高十倍以上，HBV耐藥變異的產(chǎn)生無法完全避免，目前已有報道發(fā)現(xiàn)針對拉米夫定（Lamivudine，LAM）以及阿德福韋酯（adfovirdipivoxil，ADV）預(yù)存耐藥變異的病例［2－3］。因此，加強耐藥管理，優(yōu)化治療顯得更為主動。本研究旨在通過分析81例慢乙型肝炎患者HBV耐藥突變位點的臨床特點、基因型分布及病毒學(xué)特征，為臨床抗病毒治療與監(jiān)測提供參考價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年6至2013年6月在合肥市傳染病醫(yī)院門診就診和住院的慢性乙型肝炎（CHB）患者81例，其中男46例、女35例，年齡18～72歲，平均（36±11）歲。CHB的診斷參照《慢性乙型肝炎防治指南（2010版）》［1］中的標(biāo)準(zhǔn)，所有病例甲、丙、丁、戊型肝炎均陰性，并按是否發(fā)生基因耐藥位點變異分為變異組和非變異組。

1.2 試劑與儀器 美國ABI7300型實時熒光定量分析儀；廈門安普利9800型全自動熒光定量基因擴增儀；日立H7180型全自動生化分析儀；羅氏電化學(xué)發(fā)光儀；深圳亞能分子雜交儀。HBV－DNA試劑使用廈門安普利公司生產(chǎn)；乙型肝炎E抗原（HbeAg）測定使用羅氏公司生產(chǎn)試劑；HBV基因分型與耐藥位點變異檢測使用深圳亞能公司生產(chǎn)試劑；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）濃度檢測使用寧波美康酶法試劑盒。

1.3 方法 用一次性無菌真空采血管抽取受檢者靜脈血2 mL，1 500r/min離心5min，吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至1.5mL滅菌離心管中。標(biāo)本可立即用于處理，也可－20℃儲存?zhèn)溆?。熒光定量HBV－DNA的檢測采用廈門安普利9800型全自動基因擴增儀，試劑由安普利公司提供，按說明書要求操作。HBV基因分型以及耐藥突變基因位點檢測，利用PCR結(jié)合DNA基因芯片反向斑點雜交技術(shù)，可同時在同一芯片上檢測B、C、D 3種常見基因型以及6個常見突變位點（rt180M、rt207I、rt204I、rt181V、rt236T、rt204V）。HBeAg定量檢測采用電化學(xué)發(fā)光法；血清ALT、AST濃度檢測采用動態(tài)速率法在生化儀上直接檢測結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 HBV病毒載量對數(shù)值、ALT、AST等計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，率及構(gòu)成比等計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乙型肝炎患者基因型分布及其與HBV－DNA載量、HBeAg水平和ALT、AST水平的關(guān)系 81例慢乙型肝炎患者中，B型38例占46.9%，C型38例占46.9%，B、C混合型5例占6.2%；未發(fā)現(xiàn)其他基因型?；蛐蜑锽型和C型兩組HBV－DNA載量的對數(shù)值、HBeAg水平和ALT、AST水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩種基因型患者HBV－DNA載量、HBeAg、ALT、AST水平的比較（）

基因型 n HBV－DNA（lg U/mL）HBeAg（COL）ALT（U/L）AST（U/L）.5 C型 38 5.26±2.09 261.7±51.1 85.6±20.3 9.8±16.8 t 0.682 1.325 1.568 1.862 P＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 B型 38 5.34±2.15 215.8±40.2 119.7±32.5 108.3±26

2.2 HBV變異組與非變異組HBV－DNA載量、HBeAg、ALT、AST水平的比較 將81例CHB患者分為變異組和非變異組。81例CHB患者中HBV發(fā)生耐藥位點變異的為43例，占53.1%。變異組HBV－DNA水平明顯高于非變異組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；變異組的ALT和AST水平明顯低于非變異組（P＜0.05）；變異組與非變異組的HbeAg水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 HBV變異組與非變異組病毒載量、HBeAg、ALT、AST水平的比較（）

組別 n HBV－DNA（lg U/mL）HBeAg（COL）ALT（U/L）AST（U/L）變異組 43 5.91±2.26 212.3±48.9 131.5±25.6 71.9±15.8非變異組38 4.40±2.01 273.3±61.2 338.6±76.3 203.7±44.7 t 2.436 1.863 2.982 4.361 P＜0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.01

2.3 HBV基因突變位點與基因型之間的關(guān)系 在43例發(fā)生耐藥基因位點變異的患者中，C基因型的突變率為60.5%，B基因型突變率為39.5%，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在15例發(fā)生rt204I位點的突變中，B基因型突變率為60.0%，明顯高于C基因型的40.0%，在4例發(fā)生rt204V位點的突變中，B基因型的突變率（75.0%）也明顯高于C基因型的突變率（25.0%），二者比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在18例發(fā)生rt180M＋rt204I/rt204V混合位點的突變中和發(fā)生rt181V位點的突變中，C基因型突變率明顯高于B基因型的突變率，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 HBV基因突變位點與病毒載量的關(guān)系 在15例發(fā)生rt204I位點的突變中，B基因型組HBV－DNA載量（U/mL）對數(shù)值為5.73±1.77，C基因型組為6.93±2.12。在4例發(fā)生rt204V位點的突變中，B基因HBV－DNA載量（U/mL）對數(shù)值為6.85±2.06，C基因型組為4.17±1.15，二者比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而在18例發(fā)生rt180M＋rt204I/rt204V混合位點的突變中，B基因型組和C基因型組的HBVDNA載量對數(shù)值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

目前，我國流行的HBV基因型主要以B基因型和C基因型為主，HBV基因型存在地理分布差異，北方以C基因型為主，南方以B基因型為主［4－5］。本研究中，B基因型38例占46.9%；C基因型38例占46.9%；B、C混合型5例占6.2%；未發(fā)現(xiàn)其他基因型，提示本地區(qū)HBV感染基因型主要為B型和C型。研究結(jié)果提示，B基因型患者血清HBV－DNA水平、HBeAg水平、ALT和AST的濃度與C基因型相比均無明顯差異。許利軍等［6］報道B基因型患者的HBV－DNA水平低于C基因型患者，說明在拉米夫定無良好應(yīng)答的患者中，C基因型患者更容易出現(xiàn)病毒載量升高。本研究結(jié)果與之不符，原因可能系本研究病例數(shù)不足及病例選擇有關(guān)。趙鴻等［4］對884例HBV感染者的調(diào)查結(jié)果表明，未經(jīng)抗病毒治療的B基因型患者與C基因患者之間的病毒載量無明顯差別。本研究中表2的結(jié)果顯示，變異組患者中HBV－DNA的載量值明顯高于非變異組，可能與發(fā)生耐藥基因位點突變的患者更易發(fā)生病毒反彈有關(guān)；變異組與非變異組中的HBeAg水平無顯著性差異；而非變異組中的ALT和AST水平明顯高于變異組，其原因可能是變異組的患者絕大多數(shù)為使用核苷酸類藥物治療的CHB患者，其肝組織中的炎癥程度與ALT和AST的異常程度并不相關(guān)［13］。

HBV P區(qū)位點變異是HBV對核苷（酸）類似物抗病毒藥物發(fā)生耐藥的分子基礎(chǔ)，也是病毒反彈的重要原因之一。本研究結(jié)果顯示，在對81例慢乙型肝炎患者HBV耐藥基因位點突變檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，43例患者HBV發(fā)生了耐藥基因位點的突變，在43發(fā)生基因位點突變的患者中有15例發(fā)生了rt204I位點突變占34.9%和有18例發(fā)生了rt180M＋rt204I/rt204V混合位點的突變占41.9%，其他位點的突變占23.2%，提示rt204I位點和rt180M＋rt204I/rt204V混合位點變異在患者中最為普遍，是主要發(fā)生變異的位點，與許利軍等［6］報道一致。在發(fā)生rt204I位點和rt204V位點的變異中，B基因型患者的突變率明顯高于C基因型，這一結(jié)果可以解釋潘小平等［7］研究提出的在拉米夫定耐藥突變后，B基因型以YVDD突變?yōu)橹鳌Ｔ诎l(fā)生rt181V位點和rt180M＋rt204I/rt204V混合位點的突變中，C基因型患者的突變率則明顯高于B基因型，提示B基因患者易發(fā)生rt204I位點和rt204V位點的變異，而C基因型的患者更易發(fā)生rt181V位點和rt180M＋rt204I/rt204V混合位點的變異，rt236T位點變異有待于擴大樣本量進一步研究。吳菲等［8］研究結(jié)果顯示：阿德福韋酯耐藥株感染者HBV，C基因型易發(fā)生rtAl81V/T變異，B基因型多出現(xiàn)rtN236T變異，因此，初步認(rèn)為阿德福韋酯耐藥株感染者病毒基因型與多聚酶基因區(qū)基因突變存在有一定的相關(guān)性，C基因型比B基因型更易出現(xiàn)rtAl81V/T＋rtN236T雙突變，故推測阿德福韋酯耐藥株感染者rtAl81V/T＋rtN236T雙突變可能是造成C型患者比B型存在更嚴(yán)重肝損害的原因之一。CHB的發(fā)病既與病毒因素有關(guān)，又與宿主免疫因素有關(guān)［9］。一些非常見位點變異（如S256C、L229V等）雖然未在體外表型測定證實，但是臨床調(diào)查結(jié)果顯示其與拉米夫定耐藥相關(guān)，而這些位點的變異是否在B、C基因型之間存在差別需要進一步研究［10－11］。Yuen等［12］的研究結(jié)果則顯示，B基因型的HBV能活化Th1細(xì)胞且抑制Th2細(xì)胞，而C基因型相反，提示B基因型的HBV更能誘發(fā)人體的免疫反應(yīng)，這也可能是B基因型的患者較C基因型的患者更容易出現(xiàn)良好應(yīng)答且病毒載量較低的原因之一。在本研究中C基因型的突變率為60.5%明顯高于B基因型，提示C基因型可能更易發(fā)生耐藥基因位點的突變。

本文對HBV不同基因突變位點與病毒載量的關(guān)系進行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在發(fā)生rt204I位點的突變中，B基因型組HBV－DNA載量低于C基因型組；在發(fā)生rt204V位點和rt236T位點的突變中，B基因型組HBV－DNA載量則高于C基因型組；而在發(fā)生rt180M＋rt204I/rt204V混合位點的突變中，B基因型組和C基因型組的HBV－DNA載量無明顯差別，關(guān)于HBV其他基因型的變異特點，還需要擴大樣本，作進一步的研究證實。

總之，HBV耐藥基因突變一方面可出現(xiàn)對藥物的耐受性，另一方面其復(fù)制能力也受到影響，而HBV－DNA載量作為與感染者預(yù)后直接相關(guān)的因素，決定了病情的進展。如果耐藥株較野生株復(fù)制能力下降，則相應(yīng)病毒載量會維持在一個較低水平，反之耐藥株復(fù)制能力增強則可能加速病情進展。本文對慢乙型肝炎患者HBV耐藥突變位點的臨床特點、基因型分布及病毒學(xué)特征進行了初步研究，旨在為臨床抗病毒治療與監(jiān)測提供參考價值。

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10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.045

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