王 娟，楊 柳，馬越云 綜述，郝曉柯審校

（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗科，陜西西安，710032）

近年來，國內(nèi)外圍繞循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）在結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等實體腫瘤中的應(yīng)用價值展開了多項探索性研究。食品藥物監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)了CellSearch檢測的結(jié)果可作為轉(zhuǎn)移性的結(jié)腸癌、前列腺癌和乳腺癌 的 預(yù) 測 指 標(biāo)，分 別 以3 個／7.5 微 千、5 個／7.5 微 千 和5個／7.5微千外周血的CTCs為Cutoff值，該值與患者臨床無進展生存期與總生存期相關(guān)。CTCs的檢測可有效地應(yīng)用于體外早期診斷，指導(dǎo)個體化治療包括臨床藥物的篩選、耐藥性的檢測，腫瘤的復(fù)發(fā)監(jiān)測以及腫瘤新藥物的開發(fā)等，為動態(tài)實時監(jiān)測患者的治療效果提供了最直接的證據(jù)。本文就循環(huán)腫瘤細(xì)胞現(xiàn)今在腫瘤個體化治療領(lǐng)域，特別是在前列腺癌個體化治療中的研究及進展做一回顧和總結(jié)。

1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測方法

如何從成百上億的血細(xì)胞中尋找CTCs仍然是現(xiàn)在面臨的問題，此外由于CTCs的易碎性和異質(zhì)性，也為其分離和檢測帶來一定困難，但CTCs檢測技術(shù)在近半個世紀(jì)得到飛躍式發(fā)展。

1.1 基于生物學(xué)特性的CTCs分離檢測技術(shù) 利用細(xì)胞表面特有的標(biāo)志物從大量的血細(xì)胞中對CTCs進行選擇及純化。負(fù)性分選是通過利用白細(xì)胞表面的特異性分子抗原，篩除白細(xì)胞而留下包括CTCs在內(nèi)的細(xì)胞進一步鑒定。正性分選則是利用上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）進行CTCs選擇。但Ep－CAM 的表達可能在CTCs經(jīng)歷上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的過程中降低，對EpCAM 低表達的CTCs選擇替代的標(biāo)志物標(biāo)記后進行捕獲也成為目前研究的熱點之一［1］。

正性分選的方法最具代表性的CellSearch平臺，可從400多億的血細(xì)胞中檢測到單個CTCs，重復(fù)性、特異性和敏感性高。CellSearch平臺也有不足：在實際應(yīng)用中，捕獲的腫瘤細(xì)胞由于純度低，利用免疫納米磁顆粒富集時對細(xì)胞固定有一定要求，以及CTCs自然降解等原因，對CTCs進行有意義的分子學(xué)分析比較困難。另外，由于CTCs的計數(shù)結(jié)果會由于不同操作者對CTCs的主觀認(rèn)知不同而不一致，該平臺的技術(shù)要求及結(jié)果判讀也對操作者的專業(yè)知識水平提出了更高的要求。所以需要一整套基于分析CTCs形態(tài)學(xué)，包括其細(xì)胞大小、圓度及細(xì)胞凋亡特性等指標(biāo)的自動化的計數(shù)程序，將學(xué)者們的認(rèn)識標(biāo)準(zhǔn)化，以便客觀定量血液中CTCs［2］?；阝}黏蛋白－11的捕獲技術(shù)可用于鑒定低表達EpCAM 的CTCs［3］。

其他基于免疫納米磁顆粒捕獲的系統(tǒng)，如AdnaGen系統(tǒng)利用RT－PCR 的方法分析腫瘤原發(fā)灶特異性的基因轉(zhuǎn)錄本［4］，從而分析CTCs的分子表征。MagSweeper系統(tǒng)以磁性棒為分離基礎(chǔ)的分離器，利用磁性棒運動產(chǎn)生的切變力洗脫血細(xì)胞，利用這種方法分離的細(xì)胞可以有效保證RNA 的質(zhì)量以便進一步進行多重定量RT－PCR 及單個CTCs中RNA 測序。VerIFAST 平臺利用兩種不相混的液體的高界面能差，確保只有被納米免疫磁顆粒吸附的細(xì)胞能通過不混溶的液體，以快速分離和篩選CTCs［5］。

馬薩諸塞州總醫(yī)院（MGH）利用細(xì)胞表面抗原的原理研發(fā)了一系列的微流控分選設(shè)備。第一代μpCTCs 芯片通過78000個涂覆有抗EpCAM 抗體的微電位點捕獲表達EpCAM的CTCs；第二代為HBCTCs芯片通過蝕刻的雙螺旋微流體通道構(gòu)造增加細(xì)胞和涂有抗EpCAM 抗體的通道管壁的接觸時間；第三代CTCs－芯片技術(shù)（CTCs－iChip）通過識別腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原來實現(xiàn)CTCs的純化。利用負(fù)性分選方法富集的CTCs可以進行包括研究單個細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在內(nèi)的各種分子層面包括對CTCs進行分型研究［6］。

另一些基于正性分選的微流控技術(shù)如NanoVelcro，設(shè)計有包被抗EpCAM 抗體的納米硅金屬導(dǎo)絲與聚二甲基硅氧烷（PDMS）混沌混合器，利用垂直液流的方式增強與CTCs的接觸［7］。GEDI平臺幾何級地增強免疫捕獲差異，通過微電位點上針對特異性抗原的抗體，在芯片上通過監(jiān)測有效的藥物靶接合實現(xiàn)預(yù)測治療反應(yīng)的目的［8］。

1.2 利用CTCs的其他生物學(xué)特性進行富集檢測技術(shù) 根據(jù)CTCs的其他生物學(xué)特性實現(xiàn)對其的分離也是方法之一。這些分離富集方法具有獲取未知的CTCs成分的潛在優(yōu)勢。例如標(biāo)記CTCs侵襲和分泌的某些特定蛋白。但這些方法建立在CTCs在體外細(xì)胞培養(yǎng)仍存活的基礎(chǔ)上，且這些體外培養(yǎng)條件需要模擬并概括和解釋CTCs的體內(nèi)生物學(xué)行為，所以有一定難度。上皮細(xì)胞免疫斑點試驗（EPISPOT）通過對存活CTCs短期內(nèi)（24～48h）釋放的特異性蛋白質(zhì)進行檢測，以此明確原發(fā)灶相關(guān)的CTCs。同樣，基于細(xì)胞黏附基質(zhì)（CAM）為基礎(chǔ)的Vita－Assay平臺，利用腫瘤細(xì)胞具有侵襲膠原基質(zhì)傾向的特性，體外分離存活的CTCs，實現(xiàn)不依賴于EpCAM 的表達來識別的CTCs，并進行CTCs計數(shù)和CTCs相關(guān)的DNA 分析。這些CTCs的分析方法在幾個轉(zhuǎn)移性前列腺癌的探索性研究中使用，包括PSMA 免疫細(xì)胞化學(xué)分析EMT 過程中的標(biāo)志物研究，陣列比較基因組雜交（CGH）和全基因組的甲基化分析［9］。

1.3 基于物理學(xué)特性的CTCs分離檢測技術(shù) 可以根據(jù)細(xì)胞的密度、大小、可變形性及電負(fù)荷等特征將CTCs與其他的血細(xì)胞之間區(qū)分，分離后的細(xì)胞根據(jù)免疫組化、免疫熒光或PCR進一步鑒定。ISET 平臺通過直徑8μm 的微孔進行血液過濾，之后對保留在過濾器上的細(xì)胞進行形態(tài)學(xué)的染色檢查或免疫細(xì)胞化學(xué)分析。分別利用CellSearch與ISET 對一批前列腺癌患者外周血的CTCs進行檢測比較，發(fā)現(xiàn)兩者只有60%的一致性，提示這兩種細(xì)胞的分離技術(shù)可以識別CTCs不同的亞群。由于兩個檢測平臺使用不同的指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)來定義不同的CTCs，可能出現(xiàn)不一樣的結(jié)果：使用ISET 平臺檢測的CTCs最終由病理學(xué)家根據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進行確定，而CellSearch平臺檢測方法對CTCs的最終鑒定則是通過細(xì)胞角蛋白的免疫熒光強度和DAPI核染色，可見兩個平臺各有特色：ISET 可以檢測出不表達特異性標(biāo)志物的CTCs而CellSearch可以收集到直徑小于8μm 的CTCs。

介電泳分離基于不同的細(xì)胞存在極化性（即電性能）差異的原理分離CTCs，避免抗體的標(biāo)記，最低限度修飾CTCs，較好保持細(xì)胞活性以便進行后續(xù)分子生物學(xué)分析［18］。迪安流分餾法（DEF）則是根據(jù)細(xì)胞體積不同［11］，采用螺旋微通道離心的方法將體積較大的CTCs與血細(xì)胞分離，再結(jié)合生物學(xué)檢測提純獲得CTCs。

1.4 其他創(chuàng)新的CTCs的分離檢測技術(shù) 新方法的研發(fā)主要集中在如何消除CTCs的生物學(xué)和物理學(xué)的偏差?？赏ㄟ^RT－PCR技術(shù)擴增特異mRNA 進行CTCs檢測，依賴RT－PCR的方法可以特定檢測全血有核細(xì)胞群中的前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄子［12］。高通量的光纖陣列掃描技術(shù)（FAST）可將掃描到的每一個旋涂在顯微鏡載玻片的有核細(xì)胞成像［13］?；诩す鈷呙璧腃TCs計數(shù)結(jié)合了與顯微鏡成像與流式細(xì)胞技術(shù)可最大化檢測CTCs，但需要細(xì)胞表達EpCAM 抗體能被觀測到。還可將涂覆有EpCAM 抗體的醫(yī)用導(dǎo)線放置到患者的肘靜脈以檢測外周血CTCs，但只能用已知的標(biāo)志物標(biāo)記CTCs［14］。

2 CTCs的臨床研究進展

由于CTCs實時反映體內(nèi)環(huán)境的動態(tài)變化，可以更準(zhǔn)確地反映病情的發(fā)展，目前常見的熱點基因檢測幾乎都可以在CTCs上實現(xiàn)。將捕獲的非小細(xì)胞肺癌患者外周血CTCs進行EGFR基因突變檢測，發(fā)現(xiàn)T790M 的突變與耐藥相關(guān)，利用濾過和FA－FISH 技術(shù)檢測ALK 基因重排可以預(yù)測非小細(xì)胞肺癌患者對克唑替尼的療效［15］。對乳腺癌患者CTCs 進行HER－2的表達檢測可以指導(dǎo)赫賽汀的用藥。對轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的血液標(biāo)本中分離的CTCs，進行KRAS、PIK3CA 及BRAF的突變情況檢測，可以預(yù)測轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的預(yù)后［16］。卵巢癌患者的CTCs中發(fā)現(xiàn)ERCC1 表達陽性的患者對鉑類治療效果不佳［17］。同時利用CellSearch和IsoFlux捕獲的CTCs也已經(jīng)證實可以實現(xiàn)單個CTCs基因分型［18－19］。多重退火和環(huán)化循環(huán)的擴增技術(shù)（MALBAC）成功實現(xiàn)了對于來自癌癥患者外周血單個CTCs 的全基因組擴增和深度測序［20］。該技術(shù)使得研究人員可以在單個細(xì)胞水平準(zhǔn)確探測全基因組拷貝數(shù)變異（CNVs）和單核苷酸變異（SNVs）［21］。除了CTCs單細(xì)胞測序技術(shù)革命，CTCs源性移植瘤模型研究可以保持與原發(fā)腫瘤相同的形態(tài)學(xué)和基因特性，可以穩(wěn)定傳代，為藥物試驗及耐藥研究提供了良好的平臺［22］。

在前列腺癌的CTCs研究過程中，IMMC－38共招募了276例轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者，對其中的231例進行了有效地評估。該研究利用CellSearch平臺在治療前后按月對患者的外周血CTCs進行持續(xù)動態(tài)的檢測。研究發(fā)現(xiàn)以CTCs 5個／7.5微升外周血為Cutoff值，治療前的CTCs基線水平對患者中位OS具有預(yù)測價值，這項臨床研究最終使得FDA 于2008年批準(zhǔn)了CellSearch平臺用于轉(zhuǎn)移性前列腺癌的評估。利用微流體芯片捕獲、RT－PCR 和FISH 技術(shù)檢測到前列腺癌患者CTCs中TMPRSS2－ERG 基因融合、雄激素受體AR 突變及AR－V7突變［23－24］，往往提示前列腺癌更具侵襲性及對恩雜魯胺和阿比特龍耐藥。其他CTCs 水平分子特征分析的內(nèi)容還包括PTEN 缺失、擴增和MYC的擴增，CTCs中Ki－67增殖很大程度上提示前列腺癌患者容易發(fā)生去勢抵抗，AR 蛋白的改變與臨床對多西他賽的反應(yīng)相關(guān)，還有對CTCs細(xì)胞的微管束研究也發(fā)現(xiàn)其與多西他賽化療的療效相關(guān)［8］，這些研究都為前列腺癌的個體化治療研究提供了方向和線索，當(dāng)然這些結(jié)果還有待更大樣本量的臨床數(shù)據(jù)驗證。

CTCs也可用于前列腺癌去勢抵抗的機制研究。AR 信號通路的重新激活是前列腺去勢抵抗的機制之一。FISH 檢測在轉(zhuǎn)移性前列腺癌CTCs中發(fā)現(xiàn)AR 基因的突變、AR 拷貝數(shù)量改變［13］。HBCTCs芯片利用單細(xì)胞免疫分型動態(tài)觀察CTCs到AR 通路的重新激活與前列腺癌耐藥有關(guān)。同時，在轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的CTCs 中也檢測到多種AR 基因突變，如W741R、V757A、R874Y、T877A。

下一代測序技術(shù)檢測前列腺癌CTCs的SNVs已經(jīng)證實與前列腺癌預(yù)后相關(guān)，而SOD2、GPX1、AR、cyclinB 和bFGF等基因的過表達與轉(zhuǎn)移相關(guān)［25］。通過全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)CTCs與原發(fā)腫瘤組織具有較高的一致性，對一例前列腺癌患者CTCs檢測發(fā)現(xiàn)73種突變類型有51種出現(xiàn)在配對組織中吻合率達70%。而腫瘤組織中的56 種突變類型有41 種在CTCs中檢出［26］。這意味著CTCs將為認(rèn)識前列腺的分子生物學(xué)機制提供新視野。

3 小 結(jié)

CTCs檢測技術(shù)近幾年在CTCs檢測敏感性和全面分析能力有了很大的提高。盡管如此，在不同平臺檢測的靈敏度和結(jié)果的驗證由于缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)而受到阻礙，這也使得臨床試驗隊列研究中判斷患者的臨床特征受到影響。因此亟待CTCs檢測技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化及認(rèn)識規(guī)范化。

關(guān)于CTCs的分類依賴于細(xì)胞分離使用的技術(shù)，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)到對特定的蛋白質(zhì)標(biāo)記（上皮和／或間充質(zhì)），目前仍存在較多的分歧。對比CellSearch和ISET 平臺，在ISET 平臺由病理學(xué)家分離鑒定為CTCs的某些細(xì)胞不能被CellSearch的抗體所識別。鑒于檢測步驟的各個環(huán)節(jié)存在太多的不一致，CTCs檢測標(biāo)準(zhǔn)化平臺的建立和臨床驗證在現(xiàn)階段來說是很難實現(xiàn)的。而且標(biāo)準(zhǔn)的制定需要病理學(xué)家、生物學(xué)家、臨床醫(yī)生、生物工程專家等各方各面的專業(yè)人士參與。最重要的是國際上首先需要對CTCs的形態(tài)學(xué)特征和標(biāo)志物達成共識，之后才是對一些亞型（上皮和／或間充質(zhì)）的CTCs做出分類。事實上，只有結(jié)合生物工程學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和生物學(xué)各學(xué)科的優(yōu)勢，才能將CTCs檢測分離技術(shù)最終走向成熟，最終有效成為實現(xiàn)腫瘤個體化治療的有力工具。

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