吳 娜， 周慧琳， 范鑫鵬， 倪 兵， 顧?？?/p>

(華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 上海 200062)

澳洲管膜蟲(chóng)纖毛器微管的熒光標(biāo)記及其激光掃描共聚焦顯微觀(guān)察

吳 娜， 周慧琳， 范鑫鵬， 倪 兵， 顧?？?/p>

(華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 上海 200062)

應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微術(shù)顯示，由FLUTAX直接熒光標(biāo)記的土壤腹毛類(lèi)纖毛蟲(chóng)澳洲管膜蟲(chóng)(Cyrtohymenaaustralis)細(xì)胞纖毛器微管中，口圍帶基部由小膜托架、小膜基部的微管束和托架間的連接微管構(gòu)成，波動(dòng)膜基部含微管骨架網(wǎng)，口圍帶后端與波動(dòng)膜后端匯合處含口底托架；額、腹、橫棘毛基部由前縱微管束、后縱微管束和橫微管束構(gòu)成，其橫棘毛基部的前縱微管束顯著發(fā)達(dá)，后縱微管束也明顯可見(jiàn)；左緣棘毛基部含發(fā)達(dá)的前縱微管束和后縱微管束，但橫微管束不明顯；右緣棘毛基部含發(fā)達(dá)或較發(fā)達(dá)的橫微管束和前縱微管束，但未見(jiàn)后縱微管束。分析表明，澳洲管膜蟲(chóng)纖毛器基部微管的分化特征具有種的特殊性，其中左、右緣棘毛基部微管的組成及發(fā)達(dá)程度不同在其他纖毛蟲(chóng)中未見(jiàn)報(bào)道。結(jié)合已有資料推測(cè)，游仆蟲(chóng)類(lèi)、尾柱蟲(chóng)類(lèi)和尖毛蟲(chóng)類(lèi)纖毛蟲(chóng)中基部微管的發(fā)達(dá)程度和建構(gòu)特征的不同與類(lèi)群間系統(tǒng)演化關(guān)系有關(guān)。

澳洲管膜蟲(chóng)；纖毛器微管；纖毛器基部微管；直接熒光標(biāo)記

腹毛類(lèi)纖毛蟲(chóng)是原生動(dòng)物中最高等的類(lèi)群，除其細(xì)胞表面形成口纖毛和體纖毛復(fù)合纖毛器外，在細(xì)胞表膜下纖毛器基部并形成附屬微管結(jié)構(gòu)，由此使細(xì)胞的全部纖毛器單元中其微管胞器均由纖毛桿微管、基體微管和基體基部微管等多種結(jié)構(gòu)組成。由于不同種類(lèi)的纖毛蟲(chóng)其微管組成呈現(xiàn)不同的特征，以纖毛器微管胞器為對(duì)象，觀(guān)察纖毛蟲(chóng)細(xì)胞纖毛器微管的分化及其組成模式不僅成為研究纖毛蟲(chóng)的形態(tài)與系統(tǒng)發(fā)生的重要內(nèi)容，也成為探索真核細(xì)胞的結(jié)構(gòu)分化與細(xì)胞調(diào)控機(jī)理的重要方面。自從Arregui等提出應(yīng)用熒光紫杉醇(FLUTAX)熒光標(biāo)記方法顯示纖毛蟲(chóng)的皮層纖毛器微管結(jié)構(gòu)后[1]，所在實(shí)驗(yàn)室采用改進(jìn)的FLUTAX熒光標(biāo)記方法[2]，顯示了游仆蟲(chóng)類(lèi)、尾柱蟲(chóng)類(lèi)和尖毛蟲(chóng)類(lèi)纖毛蟲(chóng)細(xì)胞的纖毛器微管骨架和纖毛器基部微管的組成特征，為深入認(rèn)識(shí)纖毛蟲(chóng)中微管結(jié)構(gòu)的組成及其功能提供了證據(jù)資料[3-8]。本文應(yīng)用直接熒光標(biāo)記顯示了尖毛蟲(chóng)類(lèi)纖毛蟲(chóng)澳洲管膜蟲(chóng)(Cyrtohymenaaustralis)皮層纖毛器基部微管的定位特征，取得了一些新的結(jié)果，現(xiàn)報(bào)告如下。

圖1 澳洲管膜蟲(chóng)的活體(1)及蛋白銀染色照片(2)，比例尺為20 μm

AZM—口圍帶；UM—波動(dòng)膜；FC—額棘毛；VC—腹棘毛；TC—橫棘毛；LMC—左緣棘毛；RMC—右緣棘毛；CC—尾棘毛；Ma—大核。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所使用的澳洲管膜蟲(chóng)(Cyrtohymenaaustralis)隸屬于腹毛目散毛亞目尖毛蟲(chóng)科管膜蟲(chóng)屬。土壤樣品于2012年1月采自山東省菏澤市成武縣的小麥地，利用非淹沒(méi)培養(yǎng)法[9]獲得蟲(chóng)體細(xì)胞,后用麥粒發(fā)酵產(chǎn)生的細(xì)菌為食物，建立純培養(yǎng)。該纖毛蟲(chóng)活體細(xì)胞柔軟可曲，具有黃色的皮層顆粒(圖1-1)。采用蛋白銀方法[10]顯示其纖毛圖式發(fā)現(xiàn)：其波動(dòng)膜由口內(nèi)膜和口側(cè)膜交叉形成一環(huán)形區(qū)，額、腹、橫棘毛按8-5-5模式分布，左右緣棘毛各1列，于尾部不相接，尾棘毛有3根，背觸毛有6～9列，大核有2枚，呈橢球形(圖1-2)。以上特征與前人的描述一致，故鑒定為澳洲管膜蟲(chóng)[11-12]。

1.2 標(biāo)本制備方法

應(yīng)用所在實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的FLUTAX直接熒光標(biāo)記方法[2]，并略有調(diào)整，主要步驟為：1)將纖毛蟲(chóng)吸至載玻片上，加入0.005%的皂苷，滲透1 min后，用PHEM緩沖液清洗1次；2)加入4%的多聚甲醛，固定30 s后，用PHEM 清洗1次；3)加入0.005%的TritonX-100，處理30 s后，用PHEM清洗1次；4)加入20 μL的 FLUTAX-2，避光染色8 min，之后用pH值7.2的PBS清洗6次。

1.3 激光掃描共聚焦顯微觀(guān)察與照相

應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡(LEICA TCS SP5)，打開(kāi)顯微鏡電源及熒光電源，啟動(dòng)“LAS AF”共聚焦軟件；選用FITC的激光光源與氬離子激光通道，調(diào)節(jié)激光輸出功率等至最佳狀態(tài)；選擇掃描方式和掃描參數(shù)觀(guān)察、聚焦標(biāo)本；采集共聚焦圖像，經(jīng)計(jì)算機(jī)三維重建后合成并保存圖像。

2 結(jié)果

2.1 皮層纖毛器

澳洲管膜蟲(chóng)呈長(zhǎng)橢圓形，口區(qū)略寬，尾部較細(xì)，背腹扁平，背面中部略隆起；細(xì)胞長(zhǎng)190～250 μm，寬40～80 μm，長(zhǎng)寬比約4∶1。其腹面皮層纖毛器中，口圍帶位于細(xì)胞前端，呈？狀，約占細(xì)胞長(zhǎng)度的1/3，并由50片小膜組成；波動(dòng)膜含口內(nèi)膜和口側(cè)膜各1片(圖2-4)。額、腹、橫棘毛按8-5-5模式分布，其中額棘毛按2 + 6模式排列，前2根在細(xì)胞前端，后6根位于口側(cè)膜右側(cè)；腹棘毛以3 + 2模式排列，前3根在口圍帶后部形成密集的簇狀，后2根位于橫棘毛前方；5根橫棘毛排成1列(圖2-6)。左緣棘毛1列，含30～35根棘毛；右緣棘毛1列，含35～40根棘毛。尾棘毛3根，位于細(xì)胞后端(圖2-1、2)。細(xì)胞背面皮層纖毛器由6～9列背觸毛組成(圖2-3)。

2.2 皮層纖毛器的基部微管

2.2.1 口圍帶和波動(dòng)膜的基部微管

口圍帶基部含小膜托架，階梯狀的小膜由基部向皮層內(nèi)側(cè)發(fā)出兩束短的微管束，相鄰微管束形成∧形(圖2-4)。2片波動(dòng)膜由口內(nèi)膜和口側(cè)膜組成，其前部分沿細(xì)胞口腔壁彎曲成環(huán)形，后部分成x形交叉。環(huán)形區(qū)內(nèi)，口內(nèi)膜向其右后方發(fā)出的微管束細(xì)長(zhǎng)且密集，口側(cè)膜向其左后方發(fā)出的微管束略微稀疏，微管束相互交叉形成發(fā)達(dá)的微管骨架網(wǎng)。在口圍帶后端與波動(dòng)膜后端的匯合處形成√形的口底托架，將二者緊密地聯(lián)系起來(lái)(圖2-5)。

2.2.2 額、腹、橫棘毛的基部微管

額、腹、橫棘毛基部微管由前縱微管束、后縱微管束和橫微管束組成。8根額棘毛中，前2根額棘毛由基部向皮層左前方發(fā)出長(zhǎng)度約為12 μm的前縱微管束，但其他6根額棘毛基部的前縱微管束不明顯。8根額棘毛的后縱微管束均由基部向皮層后方發(fā)出，其長(zhǎng)度為32～39 μm(圖2-4)。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡下澳洲管膜蟲(chóng)纖毛器微管的熒光標(biāo)記照片，比例尺為20 μm

1、2—腹皮層微管胞器和基部微管；3—背面微管胞器；4—口纖毛器和額棘毛基部微管，箭頭示小膜基部向口皮層發(fā)出的兩束微管；5—腹棘毛基部微管，箭頭示口底托架；6—橫棘毛基部微管，箭頭示橫棘毛基部前縱微管束，無(wú)尾箭頭示橫棘毛基部后縱微管束；7、9—右緣棘毛基部微管；8、10—左緣棘毛基部微管。圖2-1：AZM—口圍帶；UM—波動(dòng)膜；FC—額棘毛；VC—腹棘毛；TC—橫棘毛；LMC—左緣棘毛；RMC—右緣棘毛。圖2-2：FBM—額棘毛基部微管；VBM—腹棘毛基部微管；TBM—橫棘毛基部微管；LMBM—左緣棘毛基部微管；RMBM—右緣棘毛基部微管；CC—尾棘毛。圖2-3：DK—背觸毛。圖2-4：EM—口內(nèi)膜；PM—口側(cè)膜； ALM—額棘毛基部前縱微管束；PLM—額棘毛基部后縱微管束。圖2-5、6：ALM—腹棘毛基部前縱微管束；PLM—腹棘毛基部后縱微管束。圖2-7、9：RMBM—右緣棘毛基部微管；TM—右緣棘毛基部橫微管束；ALM—右緣棘毛基部前縱微管束。圖2-8、10：LMBM—左緣棘毛基部微管；ALM—左緣棘毛基部前縱微管束；PLM—左緣棘毛基部后縱微管束。

5根腹棘毛基部的前縱微管束和后縱微管束發(fā)達(dá)程度不一，其中位于口圍帶后方的3根腹棘毛，其后縱微管束均向所在皮層后方伸展，長(zhǎng)度約為23 μm，且距離口底托架最近的1根腹棘毛基部向皮層左前方發(fā)出長(zhǎng)度約為15 μm的前縱微管束。位于橫棘毛前的2根腹棘毛，其基部向皮層前方發(fā)出細(xì)長(zhǎng)的前縱微管束，向所在皮層后方發(fā)出后縱微管束(圖2-5、6)。

5根橫棘毛基部的前縱微管束和后縱微管束都很發(fā)達(dá)，其前縱微管束約45 μm，由棘毛基部向前方伸展，與位于橫棘毛前方的2根腹棘毛基部的前縱微管束匯聚，并形成一錐形區(qū)。后縱微管束的長(zhǎng)度約為30 μm，由棘毛基部向皮層后方發(fā)出。橫微管束不明顯(圖2-6)。

2.2.3 左、右緣棘毛的基部微管

前縱微管束、后縱微管束和橫微管束共同組成了左、右緣棘毛列的棘毛基部微管。其中，左、右緣棘毛基部的前縱微管束定位相似，均向所在皮層左前方伸展約16 μm。左、右緣棘毛基部的后縱微管束發(fā)達(dá)程度不一，左緣棘毛基部的后縱微管束細(xì)小，由基部向皮層右后方發(fā)出，右緣棘毛基部的后縱微管束不明顯。左緣棘毛基部的橫微管束不明顯，但右緣棘毛基部的橫微管束非常發(fā)達(dá)，由基部向皮層左側(cè)伸展，長(zhǎng)度約為40 μm。

3 討論

3.1 澳洲管膜蟲(chóng)皮層纖毛器基部微管的建構(gòu)特征

澳洲管膜蟲(chóng)皮層纖毛器基部微管中，口圍帶基部含小膜托架，在相鄰的小膜基部形成∧形微管。波動(dòng)膜的口內(nèi)膜和口側(cè)膜在其交叉形成的環(huán)形區(qū)內(nèi)發(fā)出發(fā)達(dá)的微管，并形成了相互交錯(cuò)的骨架網(wǎng)。額、腹、橫棘毛和左、右緣棘毛基部微管中，前2根額棘毛基部的前縱微管束發(fā)達(dá)，8根額棘毛的基部均含細(xì)長(zhǎng)的后縱微管束；5根腹棘毛基部均含發(fā)達(dá)的后縱微管束，其中距離口底托架最近的一根腹棘毛含粗壯的前縱微管束；橫棘毛基部的前縱微管束在其皮層前方形成一錐形區(qū)，而后縱微管束則細(xì)長(zhǎng)的分散在后方。左緣棘毛基部含前縱微管束和后縱微管束，但橫微管束不明顯；右緣棘毛基部含前縱微管束和發(fā)達(dá)的橫微管束。結(jié)果表明，澳洲管膜蟲(chóng)口纖毛器微管骨架及額、腹、橫棘毛基部微管的建構(gòu)與目前所知的尖毛類(lèi)纖毛蟲(chóng)乃至其他腹毛類(lèi)纖毛蟲(chóng)具有相似的特征，但比較其他纖毛蟲(chóng)中左、右緣棘毛基部微管均含有前縱微管束、后縱微管束和橫微管束3種微管胞器的情況[3-8]，該纖毛蟲(chóng)左、右緣棘毛的基部微管組成不同以及發(fā)達(dá)程度不一致的特征則未見(jiàn)報(bào)道。

3.2 澳洲管膜蟲(chóng)纖毛器基部微管與其他纖毛蟲(chóng)的比較

目前所在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)游仆蟲(chóng)類(lèi)、尾柱蟲(chóng)類(lèi)和尖毛蟲(chóng)類(lèi)纖毛蟲(chóng)細(xì)胞的纖毛器基部微管的組成特征的研究，觀(guān)察到游仆蟲(chóng)類(lèi)纖毛蟲(chóng)細(xì)胞的纖毛器基部微管最發(fā)達(dá)，其中伍氏游仆蟲(chóng)(Euploteswoodruffi)[3]和華美游仆蟲(chóng)(E.elegans)[4]橫棘毛的前縱微管束長(zhǎng)度約為細(xì)胞體長(zhǎng)的2/3，幾乎縱貫額、腹、橫棘毛區(qū)皮層；尾柱蟲(chóng)類(lèi)的纖毛蟲(chóng)細(xì)胞中纖毛器基部微管相對(duì)短小，如冠突偽尾柱蟲(chóng)(Pseudourostylacristata)[5]、大尾柱蟲(chóng)(Urostylagrandis)[6]中的腹棘毛等的橫微管束僅有約5 μm；尖毛蟲(chóng)類(lèi)的纖毛蟲(chóng)細(xì)胞其纖毛器基部微管中前縱微管束、后縱微管束和橫微管束都相對(duì)發(fā)達(dá)，但是在具體的棘毛基部其基部微管的數(shù)量、長(zhǎng)短和伸展方向有差異?；谟纹拖x(chóng)類(lèi)、尾柱蟲(chóng)類(lèi)和尖毛蟲(chóng)類(lèi)纖毛蟲(chóng)的基部微管的發(fā)達(dá)程度和建構(gòu)特征不同的事實(shí)，推測(cè)這可能與3個(gè)類(lèi)群的系統(tǒng)演化關(guān)系相關(guān)。澳洲管膜蟲(chóng)作為腹毛目散毛亞目尖毛蟲(chóng)科管膜蟲(chóng)屬的一種纖毛蟲(chóng)細(xì)胞，與同科的闊口尖毛蟲(chóng)(Oxytrichaplatystoma)[7]和施氏腹柱蟲(chóng)(Gastrostylasteinii)[8]比較，澳洲管膜蟲(chóng)右緣棘毛的橫微管束尤其發(fā)達(dá)，長(zhǎng)約40 μm，而左緣棘毛基部卻未見(jiàn)橫微管束；闊口尖毛蟲(chóng)左、右緣棘毛的橫微管束均發(fā)達(dá)，而施氏腹柱蟲(chóng)左緣棘毛基部發(fā)出兩束橫微管束。據(jù)此認(rèn)為，澳洲管膜蟲(chóng)的纖毛器基部微管具有種的特殊性，其在結(jié)構(gòu)的組成與分化、發(fā)達(dá)程度以及定位和定向方面，都與有著不同親緣關(guān)系的腹毛目纖毛蟲(chóng)有著差異，所得結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了纖毛蟲(chóng)細(xì)胞皮層纖毛器的形態(tài)及其微管建構(gòu)具有多樣性。

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Observation on ciliature microtubules ofCyrtohymenaaustralisusing fluorescent labeling and laser scanning confocal microscopy

WU Na, ZHOU Hui-lin, FAN Xin-peng, NI Bing, GU Fu-kang

(School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200062, China)

The ciliature microtubules in the cell cortex ofCyrtohymenaaustraliswere visualized by direct fluorescent labeling of FLUTAX and laser scanning confocal microscopy. The membranelle brackets and its connected microtubules as well as the base-associated microtubules formed the microtubular cytoskeleton of the adoral zone membranelles (AZM). The base-associated microtubules of the undulating membranelles (UM) contained microtubular cytoskeletal net. The confluence of AZM and UM contained the oral-end bracket. The base-associated microtubules of the frontal-ventral-transverse cirri (FVTC) contained anterior longitudinal microtubules (ALM), posterior longitudinal microtubules (PLM) and transverse microtubules (TM), and TC had developed ALM and visible PLM. The base-associated microtubules of the left marginal cirri (LMC) contained ALM and PLM, the base-associated microtubules of the right marginal cirri (RMC) contained TM and ALM. The results showed the distribution pattern of base microtubules ofC.australishad its species specificity, such as the components and different levels of the development of the L/RMC. According to available data, it can be supposed that differences of development levels and characteristics of construction of base microtubules in the Euplotids, Urostylids and Oxytrichids are related to their phylogenetic relationships.

Cyrtohymenaaustralis; microtubules; associated microtubules; direct fluorescent labeling

2014-06-30；

2014-08-25

國(guó)家自然科學(xué)基金(31172042)

吳 娜,碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞與分子生物學(xué)，E-mail: WUNA0308 @ 163. com；

范鑫鵬，助理研究員，研究方向?yàn)樵鷦?dòng)物細(xì)胞與分子生物學(xué)，E-mail: xpfan@bio. ecnu. edu. cn。

Q952.4

A

2095-1736(2015)01-0030-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.030