楊 翠，王 猛，武 超，夏 泉，許杜娟，

(1．安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230032;2．安徽省立醫(yī)院，安徽合肥 230001 3．安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽合肥 230022)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，化療是乳腺癌治療的一項重要措施，術(shù)后化療可以消滅人體內(nèi)可能已存在的微小轉(zhuǎn)移灶或微小殘余病灶，延長病人無病生存期及總生存。有相關(guān)的文獻報道化療藥物順鉑聯(lián)合17-Demethoxy-reblastain或吉西他濱治療三陰性乳腺癌［1－2]，紫杉醇聯(lián)合順鉑能有效地抑制人乳腺癌MCF-7的增殖［3]，許多化療藥物是通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而實現(xiàn)對腫瘤細胞的殺傷作用。自噬是一種細胞內(nèi)溶酶體依賴性代謝過程，通過更新和消除缺損的或多余的蛋白質(zhì)和受損或老化的細胞器來維持細胞穩(wěn)態(tài)［4]。在哺乳動物細胞中，自噬大致分為三種:(1)巨自噬是主要的自噬形式;(2)微自噬是溶酶體的膜直接包裹胞質(zhì)中的成分，形成一個內(nèi)在的囊泡并在溶酶體降解;(3)分子伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA)是胞漿中的蛋白質(zhì)與分子伴侶結(jié)合后被轉(zhuǎn)運到溶酶體腔，從而被溶酶體消化的過程。自噬是一個動態(tài)過程，可人為的將它分為四個階段［5]:(1)誘導(dǎo)和起始，而在這一過程受哺乳動物雷帕霉素(mTOR)靶點的負調(diào)控;(2)成核，受Beclin1和hVps34/classⅢ PtdIns3K復(fù)合體調(diào)控;(3)自噬體的形成，隨著隔離膜邊緣的融合，被包裹的胞質(zhì)成分完全被隔離開形成自噬體;(4)成熟和降解，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體并降解所包裹的成分，降解產(chǎn)物在細胞內(nèi)再循環(huán)利用。近年來的研究顯示，自噬在腫瘤的治療中有不可忽視的作用，而且自噬與凋亡的關(guān)系十分密切［6]。最近研究顯示，順鉑能誘導(dǎo)人癌細胞如肝癌、宮頸癌、皮膚癌等自噬，并且這種自噬對腫瘤細胞是一種保護性機制，降低腫瘤對化療藥物順鉑的敏感性［7－9]。但是，順鉑是否能誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細胞發(fā)生自噬尚無報道。本研究觀察了順鉑處理乳腺癌MCF-7細胞后自噬的發(fā)生，并初步探討了自噬在順鉑誘導(dǎo)凋亡中的作用。

1 材料與方法

1．1 細胞株和主要試劑 人乳腺癌細胞株MCF-7(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院沈玉先教授惠贈);DMEM高糖培養(yǎng)液(Hyclone生物技術(shù)有限公司);新生小牛血清(杭州四季青);甲基偶氮唑藍(MTT);吖啶橙(AO)，氯喹(Chloroquine)，Hoechst 33342，順鉑購自于sigma公司，p62/SQSTM1抗體購自MBL公司，LC3和PARP抗體購自cell signaling公司。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7為貼壁的細胞株，采用含10%熱滅活的新生小牛血清(FCS)的高糖培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)液，并加入青霉素100 IU·mL－1和鏈霉素 100 mg·L－1的培養(yǎng)體系于 37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1．2．2 MTT檢測細胞活力 取對數(shù)生長期MCF-7細胞，0．25%胰酶消化后用DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液，以每毫升5×104個細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL。培養(yǎng)24 h后分別加入既定濃度的順鉑，每組設(shè)5個復(fù)孔，每孔終體積200μL。分別培養(yǎng)24 h和48 h后，加入5 g·L－1的MTT每孔20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清，加入二甲基亞砜(DMSO)每孔150μL，微振蕩器上震蕩10 min，酶標(biāo)儀測490 nm波長處的吸光度值，取各組均值，重復(fù)實驗3次。

1．2．3 細胞凋亡檢測 細胞以每孔3×105個種在6孔板中，分為對照組、順鉑組、氯喹組、順鉑+氯喹組，處理24 h后，棄去培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌1次，固定在4%的低聚甲醛15 min，然后用PBS溶解的2 mg·L－1Hoechst 33342每孔加入1 mL，PBS洗2次(10 min)，熒光顯微鏡觀察核染色。

1．2．4 吖啶橙(AO)分析酸性自噬囊泡 細胞以每孔2×105個接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h貼壁，用不同濃度的順鉑處理24 h后，PBS洗滌2次，用吖啶橙染色(最終濃度為2 mg·L－1)室溫避光15 min，然后用PBS洗滌2次，熒光顯微鏡觀察酸性囊泡自噬體。

1．2．5 Western blot檢測 p62、LC3Ⅰ/Ⅱ、PRAP 蛋白表達 收集對照組和處理組MCF-7細胞，4℃預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入適量的含有蛋白酶抑制劑100 mmol·L－1的PMSF的RIPA(1%聚乙二醇辛基苯基醚，1%脫氧膽酸，0．1%十二烷基硫酸鈉)裂解液中于冰上裂解 30 min，4℃，12 000 r·min－1離心30 min，取上清，與5×蛋白上樣緩沖液混合后煮沸10 min，將樣品在10%的SDS-聚丙烯凝膠中進行電泳，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(PVDF)上。用5%的脫脂牛奶封閉3 h后，加入既定的抗體，4℃過夜。Tris-HCL緩沖鹽溶液(TBST)洗滌4次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫作用1 h，ECL法顯色。

1．3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均為3次獨立實驗結(jié)果，均為計量資料，通過正態(tài)性檢驗，文中以(x±s)表示。采用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組之間的比較采用t檢驗，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 順鉑對乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響 順鉑對乳腺癌MCF-7的抑制作用如圖1A所示，順鉑從低濃度至高濃度(0，2，4，8，16，32 mg·L－1)分別作用于乳腺癌MCF-7細胞24 h和48 h后，均能劑量和時間依賴地降低細胞的存活率，同時Hoechst 33342染色分析不同濃度的順鉑(0、4、8、16 mg·L－1)作用于MCF-7細胞結(jié)果顯示，順鉑呈劑量依賴性的誘導(dǎo)細胞的凋亡。如圖1B所示。

2．2 順鉑誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞自噬的發(fā)生

吖啶橙染色(acridine orange staining)觀察用不同濃度的順鉑處理MCF-7細胞24 h后，自噬關(guān)鍵的形態(tài)學(xué)特征酸性自噬溶酶體的形成，如圖2A所示8 mg·L－1順鉑能明顯誘導(dǎo)酸性自噬溶酶體的形成;Western blot結(jié)果顯示自噬標(biāo)記蛋白LC3Ⅱ和p62水平分別呈劑量依賴性增加和減少，并且8 mg·L－1順鉑能夠明顯誘導(dǎo)LC3Ⅱ表達的增加及p62表達的減少(圖2B)。同時，順鉑聯(lián)合自噬抑制劑氯喹能夠明顯增加LC3Ⅱ的表達及抑制p62的降解(圖2C)。以上結(jié)果表明順鉑誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞凋亡的同時，也誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。

2．3 順鉑誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7保護性自噬抑制了凋亡的發(fā)生 8 mg·L－1的順鉑和5μmol·L－1的氯喹(chloroquine，CQ)聯(lián)合作用MCF-7細胞24 h，聯(lián)合組與單藥順鉑組相比，細胞存活率明顯降低［(89．17%±2．56%)vs(74．63% ±1．51%)，P ＜0．05，圖 3A]，Western blot結(jié)果顯示，順鉑和氯喹聯(lián)合凋亡蛋白PRAP出現(xiàn)明顯的裂解(圖3B)。我們的結(jié)果證實，抑制自噬增強了順鉑誘導(dǎo)的乳腺癌MCF-7細胞凋亡。

3 討論

自噬是細胞通過雙層膜包裹待降解物形成自噬體，然后運送到溶酶體形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和細胞器的更新［10]。細胞在化療、饑餓、缺氧等應(yīng)激的條件下能激活細胞自噬的發(fā)生，并且自噬和凋亡密切相關(guān)。近年來研究顯示，某些化療藥物如柔紅霉素不僅能誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，而且激活了自噬［11]，以往的研究表明順鉑能誘導(dǎo)乳腺癌細胞的凋亡，但是順鉑能否誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞自噬的發(fā)生尚無報道。我們的研究結(jié)果顯示，隨著順鉑濃度的提高，對MCF-7細胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用明顯增強，同時自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ明顯增加和p62水平明顯減少，LC3和p62的特殊變化提示自噬被激活。自噬在腫瘤細胞中的作用是一把雙刃劍，一方面，自噬的發(fā)生可抑制腫瘤細胞的生長［12];另一方面自噬的發(fā)生可促進腫瘤細胞的存活［13]，最終導(dǎo)致腫瘤細胞對化療藥物抵抗。Shimizu等［14]研究顯示索拉菲尼誘導(dǎo)肝癌保護性自噬，用藥理學(xué)自噬抑制劑能增強索拉菲尼的抗腫瘤活性，Shen等［15]研究表明血管內(nèi)皮生長因子受(VEGFR)，表皮生長因子受體(EGFR)，和RET酪氨酸激酶小分子抑制劑ZD6474能提高膠質(zhì)母細胞瘤自噬水平，抑制自噬能增加ZD6474的促凋亡作用。我們的結(jié)果顯示，與順鉑相比，自噬抑制劑氯喹聯(lián)合順鉑處理MCF-7細胞后，細胞的存活率明顯下降，誘導(dǎo)凋亡作用明顯增強。這說明，順鉑誘導(dǎo)MCF-7細胞保護性自噬，它部分抑制了順鉑誘導(dǎo)的乳腺癌細胞凋亡。

總之，順鉑誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞凋亡，同時也誘導(dǎo)了保護性自噬的發(fā)生。抑制自噬能增加乳腺癌對順鉑的敏感性，順鉑聯(lián)合自噬抑制劑很可能成為治療乳腺癌的新策略，為今后乳腺癌的臨床治療提供重要的理論依據(jù)。

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