李猛猛，尹遜河，邱建華，王憲龍，李 囡

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018)

拉莫三嗪及L-硝基精氨酸對(duì)顳葉癲癇一氧化氮合酶活性、一氧化氮含量及nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

李猛猛，尹遜河*，邱建華，王憲龍，李 囡

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018)

通過(guò)測(cè)得家兔顳葉癲癇模型中一氧化氮合酶(NOS)的活性和一氧化氮(NO)的含量，研究L-NNA和拉莫三嗪對(duì)其含量變化的影響，探討NO在顳葉癲癇中的發(fā)作機(jī)制及這兩種藥物對(duì)腦部神經(jīng)元的保護(hù)作用。選取2.0～2.5 kg健康哈白兔60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、癲癇模型組、拉莫三嗪治療組和L-NNA治療組，應(yīng)用硝酸還原法測(cè)定癲癇發(fā)作后不同時(shí)間腦組織中海馬及顳葉NO的含量及NOS的活性。結(jié)果顯示：發(fā)現(xiàn)模型組腦海馬及顳葉內(nèi)NOS 的活性從6 h開(kāi)始迅速升高，1 d達(dá)到峰值，隨后逐漸降低，7 d后基本恢復(fù)正常水平，但仍高于其他各組(P<0.05)。L-NNA治療組和拉莫三嗪治療組在各時(shí)間點(diǎn)極顯著或顯著低于模型組(P<0.01或P<0.05)，L-NNA在6 h～1 d時(shí)對(duì)NOS的降低程度顯著好于拉莫三嗪組(P<0.05)。NO的變化規(guī)律與NOS變化規(guī)律基本一致且成正相關(guān)；利用SABC免疫組化染色檢測(cè)腦海馬內(nèi)神經(jīng)性NOS(nNOS)陽(yáng)性神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)模型組海馬內(nèi)CA3區(qū)nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元密度增加，胞質(zhì)著色加深，胞體的截面積和突起變?。焕褐委熃M和L-NNA治療組的神經(jīng)元密度有所降低，胞體的截面積和突起長(zhǎng)度顯著變大(P<0.05)。結(jié)果顯示：NO參與了顳葉癲癇發(fā)作的始動(dòng)過(guò)程，高濃度的NO對(duì)神經(jīng)元有損傷作用；L-NNA和新型治療藥拉莫三嗪能明顯抑制癲癇發(fā)作后NO的濃度，對(duì)腦部神經(jīng)元有一定的保護(hù)作用，從而對(duì)癲癇發(fā)作有較好的治療作用。

L-硝基精氨酸； 癲癇；海馬；一氧化氮；拉莫三嗪

顳葉癲癇(tempora lobe epilepsy，TLE)是常見(jiàn)的難治性癲癇，其發(fā)病機(jī)制及病因復(fù)雜，也是近十年有關(guān)難治性癲癇研究的熱點(diǎn)[1]。氯化鋰-匹羅卡品(LiCl—PILO)誘導(dǎo)的癲癇模型，在癲癇持續(xù)狀態(tài)下行為、病理等特性極其相似，成功的復(fù)制了人類顳葉癲癇發(fā)作。其主要病變表現(xiàn)為海馬組織神經(jīng)元缺失，星型膠質(zhì)細(xì)胞增生以及苔蘚纖維發(fā)芽，因而廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外的癲癇研究中。

NO是一種生物信使分子，由L-精氨酸在一氧化氮合酶(nitric oxide Synthase，NOS)作用下生成，其含量與NOS的活性呈正相關(guān)[2]。一氧化氮合酶在腦部有神經(jīng)元型(nNOS)、誘導(dǎo)型(iNOS)和內(nèi)皮型(eNOS)3型。一氧化氮(NO)是兼有細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信使和神經(jīng)傳遞作用的氣體物質(zhì)，它既具有通過(guò)多種途徑傳遞神經(jīng)元信息，調(diào)節(jié)腦血流量，保護(hù)神經(jīng)元的功能，在過(guò)量情況下又有廣泛的細(xì)胞毒作用。有研究表明，在各種腦病時(shí)，由于Ca2+大量?jī)?nèi)流，通過(guò)鈣調(diào)蛋白(CaM)激活iNOS，引起NO合成增加，大量的NO反過(guò)來(lái)又加重腦神經(jīng)元損傷[3]。

拉莫三嗪[4](lamotrigine，LTG)因其控制發(fā)作效果較好，對(duì)認(rèn)知損傷較輕，廣泛應(yīng)用于難治性癲癇的治療。LTG的抗癲癇機(jī)制包括抑制電壓依賴性鈉通道，穩(wěn)定細(xì)胞膜防止異常放電，抑制突觸前膜谷氨酸鹽釋放等[4]，但它是否抑制NOS的活性，減少NO的產(chǎn)生，從而對(duì)腦神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用，目前尚未見(jiàn)報(bào)道?，F(xiàn)在，NOS抑制劑已開(kāi)始用于醫(yī)療事業(yè)，應(yīng)用NOS選擇性抑制劑(L-NNA)將成為一種新的神經(jīng)保護(hù)方法，但在抗癲癇藥物的研究應(yīng)用中未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。作者采用氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的兔顳葉癲癇模型，通過(guò)測(cè)得顳葉及海馬中NOS活性和NO含量的變化，揭示其變化規(guī)律，探討拉莫三嗪和L-NNA對(duì)癲癇的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制，為癲癇藥物的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 3月齡健康哈白兔60只，體重2.0～2.5 kg，雌雄各半，購(gòu)自山東省泰安市北集坡種兔場(chǎng)，兔接種免疫適應(yīng)1周后開(kāi)始試驗(yàn)。

1.1.2 主要儀器、試劑與藥物 UV-2800A型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)，一氧化氮測(cè)試盒(硝酸還原酶法)、一氧化氮合酶活性測(cè)試盒(分型)、考馬斯亮藍(lán)測(cè)試盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；拉莫三嗪(LTG)購(gòu)自英國(guó)葛蘭素史克投資有限公司；L-硝基精氨酸(L-NNA)、匹羅卡品(PILO)、氯化鋰(LiCl)購(gòu)自Sigma公司；nNOS一抗、SABC試劑盒、DAB顯色試劑均購(gòu)自武漢博士德生物工程公司。

1.2 癲癇模型制作及動(dòng)物分組

1.2.1 匹羅卡品模型的制作 健康哈白兔腹腔注射氯化鋰(LiCl)125 mg·kg-1， 18～24 h后注射阿托品1 mg·kg-1，30 min后腹腔注射匹羅卡品(PILO)，匹羅卡品的首劑量為20 mg·kg-1，若無(wú)癲癇性發(fā)作或發(fā)作未達(dá)到 Racine制定的癲癇性發(fā)作標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ～Ⅴ級(jí)者，每隔30 min可重復(fù)腹腔注射匹羅卡品 10 mg·(kg·次)-1，直至出現(xiàn)癲癇性發(fā)作。發(fā)作程度按R.J.Racine[5]制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，達(dá)到Ⅲ～Ⅴ級(jí)的兔進(jìn)入癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)，歸于模型成功組；未達(dá)到Ⅲ～Ⅴ級(jí)的兔繼續(xù)注射 PILO 直至次數(shù)達(dá)到 6 次，其間達(dá)Ⅲ級(jí)以上的動(dòng)物也歸到模型成功組；6 次后仍未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的淘汰。癲癇模型成功后從第一次大發(fā)作開(kāi)始 SE 50 min以上者，以10%水合氯醛 3 mL·kg-1終止。對(duì)試驗(yàn)用兔給予正常飼養(yǎng)，室溫控制在25 ℃左右。造模成功后24 h內(nèi)給藥(劑量參照治療方法)。

R.J.Racine[5]的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí):無(wú)驚厥；Ⅰ級(jí):面肌抽動(dòng)、咀嚼；Ⅱ級(jí):面部陣攣伴節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí):面部陣攣、節(jié)律性點(diǎn)頭、前肢陣攣；Ⅳ級(jí):前肢陣攣、后肢站立；Ⅴ級(jí):失平衡、跌倒、四肢抽動(dòng)、全身陣攣。1.2.2 分組及藥物治療方法 將試驗(yàn)用兔分為正常對(duì)照組、癲癇模型組、 癲癇拉莫三嗪治療組、癲癇L-NNA治療組，每組14只。拉莫三嗪治療組于造模成功后每天9：00給予拉莫三嗪13 mg·kg-1灌胃；L-NNA治療組每天早晨9:00按照20 mg·kg-1L-NNA懸濁液進(jìn)行灌胃治療，直到宰殺；正常對(duì)照組以0.9%的生理鹽水代替阿托品、氯化鋰和匹羅卡品進(jìn)行腹腔注射，用 100 mg·kg-1生理鹽水代替藥物灌胃，其他條件與上述條件一致。

1.3 腦組織取材及處理

各組各時(shí)間點(diǎn)行頸總動(dòng)脈放血處死，一部分迅速取出完整腦，取海馬及顳葉立即放入4%的多聚甲醛固定液中，以備SABC免疫組織化學(xué)染色及HE染色；另一部分迅速取出完整腦組織，取海馬及顳葉低溫研磨后加冰生理鹽水制備10%的腦組織勻漿，4 ℃下3 500 r·min-1離心10 min，取上清液于-20 ℃保存待測(cè)。

1.4 一氧化氮含量和NOS活性的測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所NO測(cè)試盒(硝酸還原酶法)和NOS活性試劑盒(分型)，應(yīng)用UV-2800型分光光度計(jì)測(cè)定海馬及顳葉腦組織中 NO含量及NOS的活性。

1.5 SABC免疫組織化學(xué)染色

參照武漢博士德生物工程公司SABC免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。

1.6 切片觀察、測(cè)量

每個(gè)樣本取10張切片，在Olympus顯微鏡下觀察nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，并用網(wǎng)形和尺形測(cè)微尺計(jì)數(shù)、測(cè)量nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元的密度、胞體截面積、第一級(jí)突起數(shù)及最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組家兔海馬及顳葉NOS活性

從圖1可看出，模型組海馬及顳葉中NOS的活性比正常對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)均極顯著或顯著升高(P<0.01或P<0.05)，NOS的活性從6h開(kāi)始迅速升高，1d達(dá)到峰值，隨后逐漸降低，7d后基本恢復(fù)正常水平，但仍高于其他各組(P<0.05)。拉莫三嗪治療組和L-NNA治療組均顯著低于模型組(P<0.05)，在6h～7d內(nèi)顯著或極顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01或P<0.05)，在其他時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。拉莫三嗪治療組與L-NNA治療組相比，在6h～1d前者顯著高于后者(P<0.05)，從3d開(kāi)始兩組之間的差異不顯著(P>0.05)。

圖1 NOS活性在各組兔海馬和顳葉中的變化Fig.1 The change of NOS activity in hippocampus and temporal lobe of the four group rabbits

2.2 各組家兔海馬及顳葉NO含量

從圖2可看出，顳葉癲癇模型組海馬及顳葉腦組織NO含量于6 h后迅速升高，在1 d達(dá)到峰值，2～3 d含量有所降低，7 d后含量仍高于正常對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)，與NOS活性的變化規(guī)律基本一致。與顳葉癲癇模型組相比，L-NNA治療組和拉莫三嗪治療組NO含量在6 h～3 d各時(shí)間點(diǎn)均顯著或及顯著降低(P<0.01或P<0.05)，7 d后差異不顯著(P>0.05)。L-NNA治療組在6 h～1 d NO含量顯著低于拉莫三嗪組(P<0.05)，從3 d開(kāi)始兩者之間的差異不顯著(P>0.05)。從圖2中還知，前期L-NNA治療組比拉莫三嗪治療組對(duì)NO的降低程度大。

圖2 NO的含量在各組兔海馬和顳葉中的變化Fig.2 The changes of NO content of hippocampus and temporal lobe at the four groups of rabbit

2.3 各組家兔海馬nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元的變化

經(jīng)SABC免疫組織化學(xué)檢測(cè)(圖3)可知：正常對(duì)照組nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元主要散布在齒狀回和海馬的分子層及多形層，錐體細(xì)胞層大部分未著色，只有較少部分呈陽(yáng)性反應(yīng)。海馬的CA3區(qū)著色明顯。陽(yáng)性細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞體大且染色深，突起多而長(zhǎng)。胞體形態(tài)主要有錐體形和圓形2種。免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色，主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，染色均勻，細(xì)胞核不著色。

模型組與正常對(duì)照組相比，海馬CA3區(qū)nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元密度增加，胞體的截面積變小，突起的長(zhǎng)度和第一級(jí)突起數(shù)量減小，二者差異顯著(P<0.05)；拉莫三嗪治療組和L-NNA治療組與模型組相比，陽(yáng)性神經(jīng)元密度顯著降低(P<0.05)，胞體截面積增大，突起的長(zhǎng)度與第一突起的數(shù)量增加。兩個(gè)治療組相比陽(yáng)性神經(jīng)元密度L-NNA組顯著低于拉莫三嗪組(P<0.05)，其他指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。

A.癲癇模型組10 d CA3區(qū) nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元的分布；B.拉莫三嗪治療組10 d CA3區(qū)nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元的分布；C.L-NNA治療組10 d CA3區(qū)nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元的分布；黑色箭頭表示nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元A.The distribution of nNOS positive neurons in the epilepsy after 10 days in CA3 region of hippocampus；B.The distribution of nNOS positive neurons in the treatment group of lamotrigine in CA3 region of hippocampus；C.The distribution of nNOS positive neurons in the treatment group of L-NNA in CA3 region of hippocampus圖3 兔顳葉癲癇中CA3區(qū)nNOS 陽(yáng)性神經(jīng)元的分布(比例尺：50 μm)Fig.3 The distribution of Nnos positive neurons in CA3 region of hippocampus in the temporal lobe epilepsy rabbits (Bar=50 μm)

3 討 論

3.1 顳葉癲癇不同時(shí)間NOS活性、nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元及NO含量的變化

癲癇發(fā)作后各組NO的含量變化與NOS的活性變化規(guī)律相一致，且成正相關(guān)。在癲癇發(fā)作后6 h血清中NO的含量迅速升高，2～3 d含量有所降低，但仍明顯高于正常對(duì)照組，7 d后則基本恢復(fù)正常。NO的這種含量變化與張映琦等[6]的研究結(jié)果相一致，說(shuō)明在NOS作用下產(chǎn)生的NO參與了癲癇發(fā)作的始動(dòng)過(guò)程。拉莫三嗪治療組和L-NNA治療組在各時(shí)間點(diǎn)NOS的活性及NO含量與模型組相比顯著降低(P<0.05)，免疫組織化學(xué)也顯示，海馬CA3區(qū)nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元密度顯著降低，胞體截面積增大，突起的長(zhǎng)度與第一級(jí)突起的數(shù)量增加，這些與姚君茹等[7]在大鼠海馬的研究和施溯筠等[8]測(cè)得小鼠血清的結(jié)果相類似。說(shuō)明這兩種藥物能降低海馬內(nèi)NOS的活性，減少NO的產(chǎn)生量，從而減輕了癲癇發(fā)作后過(guò)量的NO導(dǎo)致的神經(jīng)毒性作用，具有保護(hù)腦神經(jīng)元的作用。

3.2 NO參與顳葉癲癇機(jī)制

NO是在NOS的催化下由L-Arg生成，NOS在腦內(nèi)廣泛存在。NO屬于一種自由基，分子中有一個(gè)未配對(duì)電子，容易與氧、超氧化物自由基發(fā)生反應(yīng)，很快被氧化成硝酸和亞硝酸鹽而失去生物活性[9]。NO 的產(chǎn)生過(guò)程與N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸受體(NMDAR)有密切的關(guān)系。有研究[10]認(rèn)為NO不僅通過(guò)NMDAR介導(dǎo)谷氨酸的神經(jīng)傳遞，而且當(dāng)NO大量產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣超載時(shí)，還介導(dǎo)著谷氨酸的神經(jīng)毒性作用導(dǎo)致細(xì)胞死亡。谷氨酸(Glu)與NMDA受體結(jié)合可引起Ca2+內(nèi)流，在癲癇發(fā)病機(jī)制中起重要作用[11]。在正常生理?xiàng)l件下NO失去其不成對(duì)電子時(shí)形成氧化型亞硝酸離子(NO+)，它能與NMDA受體結(jié)合氧化還原調(diào)節(jié)部位的巰基反應(yīng)，使其亞硝酸化而形成二硫鍵，這一作用既調(diào)節(jié)了NMDA受體調(diào)控的離子通道，避免了細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載所致的毒性，也防止了NO與超氧陰離子反應(yīng)所致的神經(jīng)毒性作用。

而NO的大量產(chǎn)生使得細(xì)胞內(nèi)鈣超載，過(guò)量的鈣離子與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，激活iNOS進(jìn)而使NO合成增加，氧自由基也會(huì)隨著Ca2+的升高而增多。病理狀態(tài)下NO易得到一個(gè)電子時(shí)形成還原型的NO-，能夠與超氧陰離子迅速反應(yīng)，生成過(guò)氧化亞硝基陰離子(ONOO-)。ONOO-質(zhì)子化后進(jìn)一步生成過(guò)氧化亞硝酸，并在酸性環(huán)境中進(jìn)一步分解成具有很強(qiáng)毒性的羥自由基及二氧化氮自由基，進(jìn)而導(dǎo)致膜功能失調(diào)，影響膜離子通道，從而引起膜的電生理紊亂而出現(xiàn)癲癇發(fā)作[12]。

3.3 匹羅卡品誘導(dǎo)的顳葉癲癇機(jī)制

研究表明，匹羅卡品致癲癇模型中可導(dǎo)致海馬區(qū)的特異性損傷，表現(xiàn)為海馬神經(jīng)細(xì)胞損失、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，海馬齒狀回和CA3區(qū)苔蘚纖維發(fā)芽，這些神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的改變導(dǎo)致神經(jīng)興奮異常通路成為癲癇晚期的病變基礎(chǔ)。神經(jīng)元是電興奮的主體，匹羅卡品致癲癇形成后，海馬的門(mén)區(qū)和CA3區(qū)以γ-氨基丁酸(GABA)為主的抑制性中間神經(jīng)元減少，興奮性的齒狀回顆粒細(xì)胞增多，使得興奮-抑制平衡破壞，進(jìn)而促成癲癇發(fā)作[13]。同時(shí)癲癇發(fā)病機(jī)制也與星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間建立的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)有關(guān)，癲癇使得信息交流抑制影響了突觸的調(diào)節(jié)功能。星形膠質(zhì)細(xì)胞還參與細(xì)胞外離子和神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)以及分泌細(xì)胞外基質(zhì)分子和生長(zhǎng)因子，后兩者影響神經(jīng)元的存活以及軸突、樹(shù)突的出芽，與癲癇時(shí)興奮性回路的形成和反復(fù)有關(guān)[14]。

苔蘚纖維出芽是人類顳葉癲癇的典型病理學(xué)特征[15]。海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的軸突稱為苔蘚纖維(MF)， 苔蘚纖維與齒狀回(DG)門(mén)區(qū)中間神經(jīng)元及CA3 區(qū)錐體細(xì)胞的樹(shù)突可以建立神經(jīng)聯(lián)系，進(jìn)而傳導(dǎo)神經(jīng)沖動(dòng)。癲癇發(fā)作CA3區(qū)錐體細(xì)胞損傷，導(dǎo)致苔蘚纖維與靶細(xì)胞斷離，阻礙了苔蘚纖維正常出芽和與顆粒細(xì)胞的樹(shù)突建立正常的突觸聯(lián)系。 李國(guó)良等[16]在匹羅卡品誘導(dǎo)的顳葉癲癇的研究中也發(fā)現(xiàn)，在SE后 3～7 d時(shí)，海馬齒狀回內(nèi)分子層未見(jiàn)明顯的苔蘚纖維出芽，從第15天開(kāi)始，海馬齒狀回內(nèi)分子層有明顯的苔蘚纖維出芽，到第30天及第60天時(shí)出芽更加明顯，而對(duì)照組卻未見(jiàn)苔蘚纖維出芽。

3.4 拉莫三嗪和NOS抑制劑L-NNA在顳葉癲癇中的作用

拉莫三嗪(LTG)是一種新型抗癲藥，其作用機(jī)制為:抑制電壓依賴式Ha型鈉通道，穩(wěn)定細(xì)胞膜防止異常放電的產(chǎn)生，抑制前膜谷氨酸鹽釋放[17]。本次試驗(yàn)還得知，拉莫三嗪治療組顯著降低了癲癇模型腦組織中NOS的活性和NO含量，使海馬CA3區(qū)nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元胞體截面積增大，突起的長(zhǎng)度與第一級(jí)突起的數(shù)量增加，對(duì)海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用。

L-NNA是一種NOS抑制劑，它可抑制腦組織內(nèi)的NOS的活性，使NO的合成量減少，進(jìn)而減輕了癲癇發(fā)作后由于NO的濃度升高而導(dǎo)致的神經(jīng)毒性作用，具有保護(hù)腦神經(jīng)元的作用。

4 結(jié) 論

NO參與了癲癇發(fā)作的過(guò)程，高濃度的NO對(duì)腦部神經(jīng)元有神經(jīng)毒性作用。由于NO的含量與NOS活性呈正相關(guān)，所以NO和NOS在癲癇發(fā)作中發(fā)揮了重要作用。拉莫三嗪在中后期能顯著降低癲癇發(fā)作后腦海馬及顳葉的NOS活性及NO含量，減輕高濃度的NO對(duì)海馬神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用，從而發(fā)揮保護(hù)作用。NOS抑制劑L-NNA能夠直接抑制NOS的活性，進(jìn)而降低腦部NO的含量，從而降低了癲癇發(fā)作后NO對(duì)腦部的神經(jīng)毒性作用，具有保護(hù)腦神經(jīng)元的作用。因此，拉莫三嗪和L-NNA均能用作癲癇發(fā)作后的治療藥物，然而用藥的劑量、劑型和療程等需作進(jìn)一步研究。

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(編輯 白永平)

The Influence of Lamotrigine and L-NNA on the Content of Nitric Oxide and the Activity Nitric Oxide Synthase and nNOS Positive Neurons Morphology in the Temporal Lobe Epilepsy Rabbit Induced by Pilocarpine

LI Meng-meng,YIN Xun-he*，QIU Jian-hua，WANG Xian-long，LI Nan

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

By measuring the content of Nitric Oxide and the Activity of Nitric Oxide synthase， this experiment was conducted to study the influence of lamotrigine and L-NNA on the change and investigate the mechanism of the action of NO on the cerebral hemorrhageand the protective effect of those two pharmaceuticals in the temporal lobe epilepsy rabbit induced by pilocarpine.Sixty healthy Haerbin rabbits，2.0-2.5 kg，were divided into the group of physiological saline，the epilepsy model group，and the treatment group of lamotrigine and L-NNA.Nitric Oxide (NO) content and the activity of NOS in the hippocampus and temporal lobe after epilepsy were determined by using nitrate enzyme reduction method.We found that the activity of NOS increased at 6 hours after epilpsy， and increased to the highest at 1 day， then decreased gradually and basically returned to normal level after 7 days，but it was still higher significantly than that of other groups (P<0.05).The level of NOS in two therapy groups between L-NNA and lamotrigine were lower than that in model group at every time extremely notable difference or notable difference (P<0.01 orP<0.05)，and the decreasing level of NOS in L-NNA group was lower than that of group of lamotrigine between 6 h to 1 day (P<0.05).The change of the NO content and the activity of NOS were accordant primitively and directly correlation.SABC immunohistochemical method was used to detect the neuronal NOS positive neurons in hippocampus，the density of neuronal NOS positive neurons in hippocampus’ CA3 region increased，and the cytoplasm stained darker， soma-sectional area and the length of tuber became smaller; After the treatment of lamotrigine and L-NNA，the density of neuron decreased，and the soma-sectional area and the length of tuber became significant longer (P<0.05).The results indicate that NO is involved in the initiating process of the temporal lobe seizures，and the high concentration of NO can damage the neurons；L-NNA and the novel therapeutic drug lamotrigine can inhibit the concentration of NO after epilepsy seizures，which have a better therapeutic effect on the epilepsy seizures.

N-nitro-L-arginine；epilepsy；hippocampus；nitric oxide(NO)；lamotrigine

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.018

2014-05-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30671498)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y2003D04)

李猛猛(1988-)，女，山東淄博人，碩士，主要從事神經(jīng)解剖與神經(jīng)生物學(xué)研究，E-mail：limengmengshannong@126.com

*通信作者：尹遜河(1955-)，教授，E-mail：xhyin@sdau.edu.cn，xhyin@163.com

R742.1

A

0366-6964(2015)01-0138-06