霍 焱，王榮福

北京大學(xué) 第一醫(yī)院，北京 100034

隨著人口日趨老齡化，全世界癌癥死亡人數(shù)逐年上升。全國(guó)腫瘤登記中心披露，每年新發(fā)腫瘤病例估計(jì)約為312萬(wàn)例，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)到2030年癌癥患者可超1 310萬(wàn)［1］。雖癌癥原因尚不清楚，但若能早期診斷，多數(shù)患者可通過(guò)手術(shù)治療、化療、放療或聯(lián)合治療而改善生存質(zhì)量甚至延長(zhǎng)生命。正電子發(fā)射斷層成像（positron emission tomography，PET），利用人體生命元素諸如18F、11C、15O、13N等正電子核素標(biāo)記的藥物，從體外無(wú)創(chuàng)、定量、動(dòng)態(tài)地觀察這些物質(zhì)進(jìn)入人體后隨時(shí)間變化的生理、生化變化，從分子水平洞察其在人體內(nèi)的代謝及研究受體的分布和活動(dòng)［2-3］，可對(duì)腫瘤的早期診斷、良惡性鑒別、分期、分級(jí)及療效預(yù)測(cè)顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［4］。

分子影像學(xué)反映機(jī)體組織、細(xì)胞及分子水平的代謝和功能狀態(tài)的變化，不僅是疾病早期診斷的利器，在新藥研發(fā)方面也有著巨大的應(yīng)用前景，還可為個(gè)體化治療提供指導(dǎo)［5］。因此，親腫瘤的正電子核素標(biāo)記藥物的研制和開發(fā)利用是分子影像學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)一直追求的目標(biāo)。

現(xiàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤的持續(xù)生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移與血管新生密切相關(guān)。血管新生是指從預(yù)先存在的血管中形成新血管的過(guò)程。而毛細(xì)血管細(xì)胞中粘附分子——整合素αvβ3的表達(dá)及其與特異性基質(zhì)配體如 含 精 氨 酰-甘 氨 酰-天 冬 氨 酸（arg-gly-asp，RGD）三肽的相互作用抑制腫瘤新生血管的生成并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，在腫瘤血管新生和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。在血管新生過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的整合素調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和生存。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的整合素可促進(jìn)細(xì)胞侵襲和穿越血管壁，以便于腫瘤轉(zhuǎn)移。整合素αvβ3在活化的內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中呈高度表達(dá)，但在正常的內(nèi)皮細(xì)胞和多數(shù)正常組織中呈不表達(dá)，這為抗血管新生策略提供了潛在的靶點(diǎn)［6］。

1 18F標(biāo)記藥物方法學(xué)應(yīng)用研究與新進(jìn)展

正電子核素18F可通過(guò)取代有機(jī)化合物分子中的羥基、硝基或氫原子，實(shí)現(xiàn)藥物的18F標(biāo)記。18F為缺中子核素由醫(yī)用回旋加速器生產(chǎn)獲得。同時(shí)18F所發(fā)射的正電子與周圍負(fù)電子作用發(fā)生湮沒(méi)輻射，產(chǎn)生二個(gè)方向相反、能量均為511keV的光子。用符合探測(cè)線路測(cè)量這二個(gè)光子，比常用的直接測(cè)量方法空間分辨率好、靈敏度高，且不受組織厚度影響。18F的半衰期為110min，因此可以在較短時(shí)間內(nèi)重復(fù)給藥，以研究不同生理、病理狀態(tài)下示蹤劑的分布。同時(shí)藥物的標(biāo)記要求快速、自動(dòng)化，制備和質(zhì)控檢驗(yàn)需快速可行，這樣對(duì)藥物生產(chǎn)的工藝要求比較高［7］。

小分子多肽顯像劑因至多含有50個(gè)氨基酸，方便易得，易于合成，且易于放射性標(biāo)記及對(duì)其修飾，免疫原性小，易與特定靶位點(diǎn)結(jié)合，體內(nèi)分布特性好，易于被靶組織迅速攝取，因此，經(jīng)過(guò)特定修飾的多肽類似物可克服傳統(tǒng)抗體及其片段的不利藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)及顯像性質(zhì)，應(yīng)用于腫瘤顯像中［8］。

用正電子放射性核素18F標(biāo)記含RGD基序的多肽，然后用正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像／體層成像（positron emission tomography／computed tomography，PET／CT）進(jìn)行顯像可無(wú)創(chuàng)性地在活體上顯示腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中αvβ3受體的表達(dá)量變化，可間接反映新生血管生成及腫瘤的增長(zhǎng)情況，在指導(dǎo)靶向腫瘤新生血管的生物治療及療效評(píng)價(jià)方面具有重要的意義［9］。經(jīng)典的方法多采用放射性核素標(biāo)記某種特定的輔基，然后通過(guò)進(jìn)一步的化學(xué)結(jié)合方法對(duì)生物分子進(jìn)行標(biāo)記。放射性輔基的合成是18F標(biāo)記多肽過(guò)程中最關(guān)鍵的一環(huán)。18F標(biāo)記多肽大多采用18F-酞化作用（18F-acylation）方法，但該法須采用多個(gè)步驟來(lái)合成放射性標(biāo)記輔基，耗時(shí)長(zhǎng)，產(chǎn)率低［10］，這些原因?qū)е码m然放射性受體PET顯像已開展多年，但目前能應(yīng)用于臨床的仍非常少［11-12］。很多學(xué)者針對(duì)此方法做了較多改進(jìn)工作，但目前仍很難簡(jiǎn)便地進(jìn)行一步法標(biāo)記。

1．1 18F標(biāo)記輔基法

18F標(biāo)記輔基法最常用的方法是將羧基轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的高活性酯，然后再與多肽的氨基反應(yīng)。其中以18F-NFP（4-nitrophenyl-2-18F-fluoropropionate）和18F-SFB（N-succinimidyl-4-18F-fluorobenzoate）最為常用，Chin等［13］用18F經(jīng) 親 核 取代、水解、活化等步驟得到18F-NFP，其與多肽再經(jīng)多步驟反應(yīng)合成了18F-FPP（RGD）2，總共耗時(shí)170min，衰變校正后的總放化產(chǎn)率為16．9%。Tang等［14］經(jīng)氟化、水解、衍生化，三步一鍋法完成了18F-SFP的合成，再標(biāo)記蛋白質(zhì)Avastin，總耗時(shí)90min，衰變校正后的總放化產(chǎn)率為18%。所以18F標(biāo)記活化羧基輔基標(biāo)記多肽整個(gè)過(guò)程繁瑣耗時(shí)且總體標(biāo)記率低。Chang等［15］研究發(fā)現(xiàn)，多肽質(zhì)量濃度為3g／L、溫度為60℃、反應(yīng)30min時(shí)，成腙的放化產(chǎn)率為90%。雖醛與多肽氨氧基或聯(lián)氨基縮合的方法化學(xué)選擇性和反應(yīng)性好，但合成步驟長(zhǎng)，引入的輔基比較大，所以多肽的活性可能受影響。標(biāo)記輔基與多肽巰基反應(yīng)選擇性好，反應(yīng)性好，可以在水溶液中反應(yīng)，是18F標(biāo)記含巰基多肽的較好方法。但制備18F標(biāo)記輔基，需要多步合成，總標(biāo)記產(chǎn)率不高，并且引入的輔助基大，對(duì)多肽的結(jié)構(gòu)影響可能比較大。

1．2 固相標(biāo)記法

Julie等［16］在2-（7-偶氮苯并三氮唑）-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯（o-（7-azabenzotriazol-1-yl）-N，N，N′，N′-te-tramethyluronium hexafluorophosphate，HATU）和N，N-二異丙基乙胺（N，N-diisopropylethylamine，DIPEA）條件下，用固相標(biāo)記法完成18F-FBA（18F-fluorobenzaldehyde）對(duì)多肽的18F標(biāo)記。18F-FBA與保護(hù)的多肽反應(yīng)3min，再與三氯乙酸反應(yīng)7min，裂解釋放出18F標(biāo)記多肽，反應(yīng)時(shí)間短，衰變校正后的放化產(chǎn)率為70%～80%。但標(biāo)記過(guò)程中需要對(duì)多肽的羧基或氨基進(jìn)行保護(hù)，標(biāo)記完后需要脫保護(hù)，增加了很多處理步驟，不容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化合成。

1．3 點(diǎn)擊化學(xué)法

點(diǎn)擊化學(xué)法（click chemistry）于2001年由諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者美國(guó)化學(xué)家Sharpless提出，包括環(huán)加成、親核開環(huán)等反應(yīng)，由于反應(yīng)快捷，反應(yīng)位點(diǎn)準(zhǔn)確，引起了廣泛關(guān)注［17］。2006年Marik等［18］將點(diǎn)擊化學(xué)運(yùn)用于放射性藥物的合成及標(biāo)記中，成功的實(shí)現(xiàn)了多肽的18F標(biāo)記［19］。主要有兩種標(biāo)記途徑：1）帶炔基的18F標(biāo)記輔基與帶疊氮基團(tuán)的多肽反應(yīng)；2）帶疊氮基團(tuán)的18F標(biāo)記輔基和帶炔端的多肽反應(yīng)。Ramenda等［20］用帶有疊氮的多肽與帶有18F標(biāo)記的末端炔在硫酸銅催化下，40℃反應(yīng)20min，得到18F標(biāo)記的多肽，總反應(yīng)時(shí)間45min，衰變校正后的放化產(chǎn)率為69%±11%。利用點(diǎn)擊化學(xué)將炔和疊氮化合物進(jìn)行環(huán)加成反應(yīng)，進(jìn)行多肽的18F標(biāo)記，雖然點(diǎn)擊化學(xué)標(biāo)記率高（大于80%），但是該方法需要多步合成和分離，耗時(shí)長(zhǎng)。另外，在生物分子上引入硅基團(tuán)也可以實(shí)現(xiàn)18F一步標(biāo)記。但是所形成的標(biāo)記物不穩(wěn)定，必須在硅上引入特丁基，修飾基團(tuán)增大了化合物的脂溶性，同時(shí)降低了化合物和靶標(biāo)的特異性結(jié)合。所以點(diǎn)擊化學(xué)法的標(biāo)記產(chǎn)率高，選擇性好，對(duì)氧氣和水不敏感。但是該方法需要多步反應(yīng)引入末端炔基或疊氮基團(tuán)。

1．4 18F-AlF絡(luò)合標(biāo)記法

18F-易與金屬（如鋁）結(jié)合，生成的18F-鋁配合物（18F-Al）可與螯合基團(tuán)（如1，4，7-三乙酰唑胺環(huán) 壬 烷-1，4，7-三乙酸鹽（1，4，7-triaza cyclononane-1，4，7-triacetic acid，NOTA））連接。2009年，Mc Bride等［21］用18F-KF和AlCl3反應(yīng)形成（18F-AlF）2＋，然后跟連接在多肽上的NOTA配體發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成標(biāo)記絡(luò)合物。在45min內(nèi)完成多肽化合物的18F標(biāo)記和高效液相層析（high performance liquid chromatography，HPLC）分離，標(biāo)記率達(dá)到50%。（18F-AlF）2＋絡(luò)合多肽NOTA修飾化合物在體外血清實(shí)驗(yàn)中具有良好的穩(wěn)定性［22-23］。

Liu等［24］用NOTA修飾［c（RGDyK）］2，得到化合物NOTA-RGD2，將其與18F-AlF通過(guò)螯合反應(yīng)獲得標(biāo)記化合物，制得18F-AlF-NOTARGD2，整個(gè)生成過(guò)程無(wú)需制備前體18F-SFB、18FNFP，無(wú)需微量水質(zhì)分析儀（quality moisture analyzer，QMA）柱純化，無(wú)需HPLC純化。實(shí)現(xiàn)鋁一步法18F標(biāo)記RGD多肽。Zhan等［25］利用PRGD2肽凍干試劑盒，用一步法便捷合成具有優(yōu)異放化純度和產(chǎn)量的18F-Al-NOTA-PRGD2。在最佳條件下，18F-Al-fatide包括純化在內(nèi)的整個(gè)放射合成可在20min內(nèi)完成，放化產(chǎn)率為（42．1±2．0）%，純度大于95%。臨床試驗(yàn) 表明，18F-Alfatide的PET顯像可清晰顯示腫瘤，平均腫瘤攝取為（2．90±0．10）%ID／g。Mercier等［26］采用18F-AlF鰲合法用一步法實(shí)現(xiàn)RGD多肽的18F標(biāo)記，用Sep-Pak分離柱純化即可使18F-AlFNOTA-PRGD2的放化純度大于95%，與Liu等［24］報(bào)道相一致，該肽自標(biāo)記到純化總的時(shí)間僅為40min左右。與傳統(tǒng)的18F-SFB酞化反應(yīng)標(biāo)記法相比，此標(biāo)記方法及純化過(guò)程明顯簡(jiǎn)化，方便、易行、快捷，提示該法將比較適合于臨床應(yīng)用，從而大大提高了18F標(biāo)記RGD多肽向臨床應(yīng)用的可能性。

醫(yī)用回旋加速器生產(chǎn)18F后，用0．4mol／L碳酸氫鉀溶液淋洗后，用不含有金屬的冰醋酸將其pH調(diào)節(jié)到4．0，隨后加入溶于0．1mmol／L乙酸鈉（pH＝4）的氯化鋁（2mmol／L，3μL）和溶于二甲基亞砜的NOTA-RGD2。以上反應(yīng)混合物在100℃下反應(yīng)15～20min，反應(yīng)結(jié)束后用去離子水稀釋，然后用Sep-Pak分離柱純化。收集含有18F-AlF-NOTA-RGD2的液體并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除溶劑，所獲得的標(biāo)記化合物用磷酸緩沖液（pH＝7．4）進(jìn)行稀釋后用0．22μm微孔過(guò)濾器除菌備用。

一步法標(biāo)記18F-AlF-NOTA-RGD2的反應(yīng)時(shí)間為15～20min，用Sep-Pak分離柱純化時(shí)間8～12min，總放化合成所需時(shí)間約為40min，未經(jīng)衰變校正的放射性標(biāo)記產(chǎn)率為17%～25%。采用Sep-Pak分離柱純化而無(wú)需經(jīng)HPLC純化后18FAlF-NOTA-RGD2的放射化學(xué)純度大于95%。

綜上所述，18F標(biāo)記RGD肽類不僅不會(huì)改變多肽空間結(jié)構(gòu)，而且與受體結(jié)合力及親和力都很高，用18F-AlF鰲合法標(biāo)記制備靶向整合素αvβ3受體的新型顯像劑18F-AlF-NOTA-RGD方法簡(jiǎn)便、易行，一步便能完成。其藥代動(dòng)力學(xué)與18F-FPPRGD2極其相似，在小動(dòng)物PET顯像中也體現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)［19，27-28］。

2 前景與展望

隨著PET、PET／CT技術(shù)的迅速發(fā)展，其中95%以上用于腫瘤診斷，且臨床價(jià)值已得到了肯定。然而，目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用的腫瘤正電子藥物有非常大的局限性，大多使用眾所周知的18F-FDG，這大大限制了PET的潛在功能及應(yīng)用［29］。因此，研究和開發(fā)滿足臨床需要的高靈敏、高特異的正電子顯像劑才能真正從根本推動(dòng)分子影像學(xué)的發(fā)展。綜上所述，整合素αvβ3在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的高表達(dá)，RGD肽與整合素結(jié)合的特異性強(qiáng)、親和力高的特性，用放射性核素標(biāo)記的RGD肽在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)取得了一系列的成果，且進(jìn)行了初步的臨床研究［30］。但RGD肽及其各種不同的修飾結(jié)構(gòu)，作為小分子多肽配體主要存在正常肝、腎組織的攝取較多的問(wèn)題，這樣將會(huì)給轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)帶來(lái)困難。所以需要尋找一種更理想的小分子多肽顯像配體，本課題組前期在荷瘤人前列腺癌PC3裸鼠的初步體內(nèi)生物分布實(shí)驗(yàn)及SPECT顯像結(jié)果顯示，應(yīng)用氯胺-T方法將131I成功標(biāo)記小分子多肽精氨酰-精氨酰-亮氨酸（arg-arg-leu，RRL），其具有良好生物學(xué)［31-32］和藥理學(xué)性能，荷瘤動(dòng)物模型顯像可見(jiàn)131I-RRL特異性地聚集于腫瘤部位［33］，同時(shí)用99Tcm標(biāo)記的RRL在原位腫瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤實(shí)驗(yàn)研究均觀察到腫瘤部位可見(jiàn)明顯放射性濃聚，腫瘤病灶顯影清晰［34-35］。用單光子放射性核素標(biāo)記的小分子多肽可用于腫瘤核醫(yī)學(xué)分子功能成像［36］，同時(shí)可以考慮用正電子放射性核素18F標(biāo)記RRL進(jìn)行活體腫瘤顯像研究［37-39］，以便于此肽在臨床上更好的應(yīng)用，相信可以為腫瘤靶向血管顯像及靶向生物放射治療提供一種更優(yōu)的手段或方法。

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