第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅(西安710032) 白 威 楊薛康 楊國棟

·論著·基礎(chǔ)研究·

鈉氫交換蛋白1抑制劑對(duì)膿毒癥大鼠心臟損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究*

第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅(西安710032) 白 威 楊薛康△楊國棟▲

目的：觀察鈉氫交換蛋白1(NHE1)抑制劑對(duì)膿毒癥大鼠心臟損傷的保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)制。方法：常規(guī)方法建立大鼠膿毒癥模型誘導(dǎo)心臟損傷。將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、膿毒癥組和膿毒癥治療組,膿毒癥治療組大鼠注射鈉氫交換蛋白1抑制劑卡立泊來德,于傷后12h檢測(cè)左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6 (IL-6)、髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和丙二醛(MDA)水平。結(jié)果：膿毒癥組大鼠心臟損傷高于對(duì)照組,表現(xiàn)為L(zhǎng)VEF值的降低和LDH、CK、CK-MB值的升高；膿毒癥治療組大鼠較膿毒癥組大鼠心臟損傷顯著減輕,表現(xiàn)為L(zhǎng)VEF值的升高、LDH、CK和CK-MB值的降低。膿毒癥組大鼠TNF-α、IL-6、MPO、MDA水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SOD、CAT和GPx水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療組大鼠上述指標(biāo)顯著改善。結(jié)論：NHE1抑制顯著減輕膿毒癥誘導(dǎo)的心臟損傷，其部分機(jī)制可能是抑制了炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。

鈉氫交換蛋白(NHE)是一種跨膜蛋白,廣泛存在于所有真核細(xì)胞表面,其主要功能是將一個(gè)氫離子泵出細(xì)胞外，并獲得一個(gè)鈉離子，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的pH值[1-3]。NHE1是NHE家族中表達(dá)最為廣泛的亞型，在組織的缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2-4]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，NHE1在燒傷后顯著活化，NHE1的抑制劑卡立泊來德可以減輕燒傷后的心臟損傷[5]。膿毒癥是燒傷后常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，在本實(shí)驗(yàn)中，我們建立大鼠膿毒癥模型，觀察NHE1在膿毒癥心臟損傷中的作用，并初步探討其可能的機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 健康無特殊病原體級(jí)雄性SD大鼠70只,體質(zhì)量200±25g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所有實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。試劑：卡立泊來德(cariporide)為德國Hoechst公司產(chǎn)品，牛血清白蛋白、三羥甲基氨基甲烷、氯仿、甲醇、蔗糖、抗壞血酸、硫酸亞鐵和四氯化碳等實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑均為國產(chǎn)AR試劑。

2 方 法 ①動(dòng)物分組及模型建立：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，并根據(jù)隨機(jī)分組表法隨機(jī)分為對(duì)照組(10只)、膿毒癥組(30只)和膿毒癥治療組(30只)。以戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉,行腹正中切口,采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)復(fù)制膿毒癥大鼠模型。對(duì)照組除不作環(huán)形結(jié)扎和針刺穿孔外，其余操作均與膿毒癥組相同。膿毒癥治療組大鼠腹腔注射卡立泊來德(0.4mg/kg)1 ml；本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。②檢測(cè)指標(biāo)與方法：大鼠于傷后12h斷頭處死,另處死對(duì)照組大鼠。大鼠斷頭后立即取血,1000 r/min離心5min,分離血漿,-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〈笫笮募〗M織,加入9倍體積的等滲鹽水制成勻漿,離心后取上清，-80℃保存檢測(cè)以下指標(biāo)。心臟功能指標(biāo)：左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)使用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。心肌損傷指標(biāo)：包括血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB),應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司產(chǎn)品)檢測(cè)。炎性指標(biāo)：包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6 (IL-6)和髓過氧化物酶(MPO),腫瘤壞死因子α(TNF-α)采用ELISA法檢測(cè),按上海森雄科技公司ELASA試劑盒說明書進(jìn)行。氧化應(yīng)激指標(biāo)：包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性和丙二醛(MDA)含量,使用南京建成科技公司試劑盒檢測(cè)。

結(jié) 果

1 NHE1抑制對(duì)膿毒癥心臟損傷的影響 與對(duì)照組相比，膿毒癥組大鼠LVEF值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療組大鼠LVEF值顯著高于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；另外，與對(duì)照組相比，膿毒癥組大鼠血清LDH、CK及CK-MB值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，治療組大鼠上述指標(biāo)較膿毒癥組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表1。

表1 3組大鼠LVEF、LDH、CK及CK-MB值變化

2 NHE1抑制對(duì)膿毒癥后炎性因子表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，膿毒癥組大鼠血清TNF-α、IL-6及MPO水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療組大鼠上述指標(biāo)較膿毒癥組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。膿毒癥組大鼠心肌組織TNF-α、IL-6及MPO水平較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療組大鼠上述指標(biāo)均低于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

3 NHE1抑制對(duì)膿毒癥后氧化損傷指標(biāo)的影響 與對(duì)照組相比,膿毒癥組大鼠血清SOD、CAT、GPx活性顯著降低,MDA含量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療組大鼠血清SOD、CAT、GPx活性較膿毒癥組明顯升高,MDA含量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。膿毒癥組大鼠心肌組織SOD、CAT、GPx活性低于對(duì)照組,MDA含量高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而治療組大鼠心肌組織SOD、CAT、GPx活性顯著高于膿毒癥組,MDA含量低于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表4、5。

表2 3組大鼠血清TNF-α、IL-6及MPO水平變化

表3 3組大鼠心肌組織TNF-α、IL-6及MPO水平變化

討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NHE1抑制劑卡立泊來德顯著減輕了膿毒癥后的心臟損傷，表現(xiàn)為心功能的改善和心肌酶的降低，進(jìn)一步證實(shí)了NHE1抑制對(duì)膿毒癥后心臟損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

雖然膿毒癥后心臟損傷的機(jī)制尚不完全清楚，但越來越多的證據(jù)表明炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激均發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[5-9]。近年的研究顯示，NHE1可以調(diào)節(jié)炎癥進(jìn)程，NHE1活化可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集，并且誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，NHE1的抑制劑可以顯著抑制炎性因子的產(chǎn)生[10-11]。在本實(shí)驗(yàn)中，NHE1抑制顯著減輕了心肌組織炎癥反應(yīng)和全身炎癥反應(yīng)。這說明NHE1抑制對(duì)膿毒癥后心臟損傷的保護(hù)作用可能與其抗炎機(jī)制有關(guān)。

表4 3組大鼠血清SOD、CAT、GPx及MDA含量變化

表5 3組大鼠心肌組織SOD、CAT、GPx及MDA含量變化

最新的研究還發(fā)現(xiàn)，NHE1在線粒體氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，NHE1的抑制可以顯著減輕活性氧的生成[12-14]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)卡立泊來德減輕了膿毒癥導(dǎo)致的氧化損傷，提高了抗氧化酶的含量，說明NHE1抑制顯著減輕了膿毒癥后的氧化應(yīng)激，提示NHE1抑制對(duì)膿毒癥后心臟損傷的保護(hù)作用也可能是對(duì)氧化應(yīng)激的抑制所致。

NHE1參與臟器損傷的機(jī)制是復(fù)雜的。在缺血再灌注損傷過程中，NHE1的活化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉離子升高，進(jìn)而活化鈉鈣泵，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加，進(jìn)而引起鈣離子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和組織損傷[3-4]。而鈣離子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和組織損傷在膿毒癥后的心肌損傷中同樣發(fā)揮著重要作用[15]。本實(shí)驗(yàn)僅明確了NHE1在膿毒癥后心臟損傷中的作用，探討了其部分機(jī)制，進(jìn)一步的研究還在繼續(xù)。

綜上，我們的研究發(fā)現(xiàn)NHE1的抑制顯著減輕了膿毒癥誘導(dǎo)的心臟損傷，其部分機(jī)制可能是通過抑制了炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。

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(收稿：2015-04-20)

Study was designed to investigate the cardioprotective role of Na+/H+exchanger 1 (NHE1) inhibition after sepsis of rats

Fourth Military Medical University(Xi’an 710032)

Bai Wei Yang Xuekang Yang Guodong

Objective: This study was designed to investigate the cardioprotective role of Na+/H+exchanger 1 (NHE1) inhibition after sepsis, and explore the potential mechanisms.Methods: A common sepsis model was used to induce cardiac injury in rats. All rats were randomly divided into 3 groups：the control group, the sepsis group and the treatment group. Changes in left ventricular ejection fraction (LVEF), the lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK), MB isoenzyme of creatine kinase (CK-MB), tumor necrosis factor (TNF-α),interleukin (IL-6),myeloperoxidase (MPO) activity, superoxidase dismutase (SOD), catalase (CAT),glutathione peroxidase (GPx) and malondialdehyde (MDA) were examined.Results: Sepsis resulted in significant cardiac injury, as manifested by lowered LVEF, increased serum LDH, CK and CK-MB, compared with the control group. NHE1 inhibition markedly alleviated cardiac injury. In addition, sepsis caused increased level of TNF-α、IL-6、MPO and MDA, and decreased of SOD、CAT and GPx, which were improved by NHE1 inhibition in treatment group.Conclusion: NHE1 inhibition alleviates sepsis-induced cardiac injury, possibly by inhibiting sepsis-induced oxidative stress and inflammation response.

Sepsis Heart injuries @Na+/H+exchanger 1

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81201463)

膿毒癥 心臟損傷 @鈉氫交換蛋白1

R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.001

△第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷與皮膚外科

▲通訊作者：第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室