林建立,詹政科,劉玉琳,范小琴,耿曉瑞,劉曉宇

粉塵螨鐵蛋白的克隆、表達及蛋白特征分析

林建立1,詹政科1,劉玉琳2,范小琴3,耿曉瑞3,劉曉宇1

目的 為了獲得粉塵螨鐵蛋白(ferritin)蛋白，并對該蛋白特征進行分析。方法 根據(jù)鐵蛋白基因已知序列,設計出相應的引物,提取粉塵螨總RNA，采用RT-PCR方法擴增出鐵蛋白基因，PCR產(chǎn)物克隆入pET32a載體,構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET32a-ferritin,經(jīng)酶切和測序鑒定后,再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3),異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達。用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定其表達效果,用Ni+離子親和層析柱純化其重組蛋白。用生物信息學方法對粉塵螨鐵蛋白的特征進行分析。結(jié)果 成功克隆粉塵螨鐵蛋白基因并構(gòu)建了pET32a-ferritin重組質(zhì)粒；粉塵螨鐵蛋白基因開放閱讀框為543 bp，編碼179個氨基酸，PI 5.35；SDS-PAGE結(jié)果表明鐵蛋白基因在大腸桿菌 Bl21(DE3)中獲得良好的表達,經(jīng)親和層析純化后, 表達產(chǎn)物分子質(zhì)量約為20 kD。經(jīng)生物信息學分析, 粉塵螨鐵蛋白含有8個絲氨酸激酶、7個蘇氨酸激酶、7個酪氨酸激酶、0組氨酸激酶磷酸化位點，親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，屬不穩(wěn)定蛋白。結(jié)論 克隆、表達了塵螨鐵蛋白，經(jīng)純化后獲得較高純度的重組蛋白，并對其三級結(jié)構(gòu)進行分析，為進一步研究塵螨過敏原的結(jié)構(gòu)成分及其理化性質(zhì)奠定理論基礎。

粉塵螨；鐵蛋白；蛋白表達、純化；生物信息學分析

塵螨是室內(nèi)最常見的過敏原，對人體過敏陽性率高達70%～80%[1]。其分泌物、排泄物和皮殼碎片等以塵埃顆粒飛揚于空氣中，過敏體質(zhì)者吸入后，可引起變應性心臟蕁麻疹、過敏性鼻炎、螨性哮喘等變態(tài)反應性疾病。據(jù)統(tǒng)計，約25%的人群對塵螨有反應性，且這種反應性具有一定的遺傳性[1]。因此，研究塵螨過敏原對保護人類的健康和維持正常的生活有重要意義[2]。

鐵蛋白是普遍存在生物體內(nèi)的一種保守性較高的多功能蛋白，其主要作用是儲存鐵，對生物體內(nèi)鐵含量進行調(diào)控，在生物體內(nèi)鐵含量較多時起到解毒作用[3-4]。而有關(guān)粉塵螨鐵蛋白的報道較少，僅在W.R.Thomas、Su An等研究中發(fā)現(xiàn)，塵螨表達鐵蛋白重鏈[5]、鐵蛋白[6]。但國內(nèi)未見對該基因及其蛋白特征的相關(guān)報道。本研究在國內(nèi)首次利用RT-PCR方法克隆出粉塵螨鐵蛋白片段，并用生物信息學方法對其分子特征進行分析，為進一步研究塵螨抗原的結(jié)構(gòu)成分及其理化性質(zhì)奠定基礎，對進一步研究粉塵螨過敏機理及其診斷試劑和疫苗的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 提取總RNA并RT-PCR,試劑盒購自QICGEN公司，RT-PCR試劑盒購自上海生工BBI公司，原核表達載體pET-32a購自Novagen 公司。pET-18a 載體、Ex-Taq 酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ與Hind Ⅲ、T4 DNA 連接酶和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自TaKaRa 公司。

1.2 粉塵螨總RNA的提取 實驗用粉塵螨由本課題組培養(yǎng)。挑取干凈的活粉塵螨，用Qicgen公司的RNeasy Mini Kit 進行總RNA 的提取，操作步驟按說明書進行。

1.3 鐵蛋白全長cDNA合成 以提取的總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，進行PCR 擴增反應。反應體系如下(50 μL)：10 × Ex Taq Buffer 5 μL；TaKaRa ExTaq 0. 25 μL；dNTP Mixture，4 μL；上下游引物各2 μL，cDNA 為模板1 μL；加去離子水至50 μL。 PCR反應條件：94 ℃變性1 min；50 ℃ 退火1 min；72 ℃延伸1 min；35 個循環(huán)，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖電泳驗證并拍照。

1.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建及酶切鑒定 將上述PCR 產(chǎn)物與pMD-18T 連接后，熱轉(zhuǎn)化至E.coliTop10 中，涂布于含氨卞霉素( 100 mg·L-1)的LB 平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，從LB 平板上挑選白色菌落放入含氨卞霉素的LB 培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。 用BamH I 酶切鑒定，重組質(zhì)粒，委托華大基因工程(深圳)有限公司進行序列，測序正確后進一步將酶切產(chǎn)物與pET-28a 表達載體37 ℃反應4 h 進行連接轉(zhuǎn)化至E.coliBL21，37 ℃ 培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落，提取質(zhì)粒后雙酶切鑒定。

1.5 鐵蛋白的誘導表達及純化 將上述鑒定的pET32a-鐵蛋白轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3),待細菌生長處于對數(shù)生長期(A600 nm =0.6～0.9)時,加入20 μL 1 mol/L的IPTG,誘導蛋白表達。誘導4 h后取1 mL菌液，離心棄上清液,加100 μL去離子水后重懸菌體，加20～25 μL 10×SDS-PAGE上樣緩沖液混合,沸水浴10 min，按照5 μL,10 μL,20 μL上樣，進行SDS-PAGE 電泳分析, 以檢測重組蛋白表達情況。誘導表達的重組蛋白，經(jīng)裂解、溶菌、超聲，將上清液以2 mL/min 的速度上樣于已平衡好的Ni-NTA 柱。然后用平衡液充分洗柱，再分別用含40 mmol/L、300 mmol/L 咪唑平衡緩沖液進行洗脫，收集各次洗脫液進行SDS-PAGE 分析。

1.6 鐵蛋白生物信息學分析 用NCBI 網(wǎng)站在線軟件分析其ORF，用ProtParam Tools 預測其理化性質(zhì)，用Translate Tool 推導其氨基酸序列，用KinasePhos 軟件預測磷酸化位點。ProtScale 預測其親水性，用列Signal P3.0分析其信號肽序，用SWISS-MODEL預測其三級結(jié)構(gòu)，用MEGA5 工具包來構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié) 果

2.1 鐵蛋白生物信息學分析

2.1.1 塵螨鐵蛋白基因編碼蛋白的理化性質(zhì) 用PmtParam對塵螨鐵蛋白基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預測，推測該蛋白的分子式為C917H1408N258O285S8，分子量是20863.3 Da，理倫等電點pl 5.35；該基因含Glu (E) 最多，占10.6%；總的帶正電殘基(Arg+Lys)為21，負電殘基(Asp+Gh)為31?？偟钠骄杷詾?0.723。該基因預測不穩(wěn)定指數(shù)是41.97，按ProtParam定義，不穩(wěn)定系數(shù)分值大于40時，預測蛋白較不穩(wěn)定，故塵螨鐵蛋白基因編碼蛋白屬不穩(wěn)定蛋白。

用KinasePhos 軟件預測磷酸化位點，預測結(jié)果表明鐵蛋白含有8個絲氨酸激酶、7個蘇氨酸激酶、7個絡氨酸激酶、0組氨酸激酶磷酸化位點。

用ProtScale軟件的Kyte and Doolittle算法對塵螨鐵蛋白進行親水性/疏水性進行分析。結(jié)果提示大約在塵螨鐵蛋白中N端起115-125為疏水區(qū)域；60-70區(qū)域的親水性最強，其次90-95、15-25、44-48、75-80、125-130區(qū)域具有較強的親水性。可見，塵螨鐵蛋白的親水區(qū)域大于疏水區(qū)域。

2.1.2 SWISS-MODEL預測蛋白三級結(jié)構(gòu) 用同源模建法，提交序列到SWISS-MODEL服務器( http://swissmodel.expasy.org/)進行自動模建，得到其三維結(jié)構(gòu)，見圖5。其結(jié)果與所選取X-衍射得到的模板序列相似性為62.86%，主要為α+β混合蛋白質(zhì),其三維結(jié)構(gòu)是一個可容納鐵的球形結(jié)構(gòu)。

圖1 塵螨鐵蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

2.1.3 同源性分析 分析顯示此粉塵螨鐵蛋白與NCBI公布的粉塵螨鐵蛋白同源性為91%，與屋塵螨鐵蛋白重鏈同源性為86%。進化樹顯示，塵螨鐵蛋白與屋塵螨、棕色蜱、變異革蜱、安氏革蜱、美洲鈍眼蜱、派氏鈍緣蜱、鐮形扇頭蜱、大池塘蝸牛、血紅扇頭蜱的同源蛋白關(guān)系較近(見圖6)。

2.2 鐵蛋白克隆、表達及純化

2.2.1 目的基因的RT-PCR擴增 用反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板, 用合成的引物進行PCR 擴增, 所得產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳,可見約550 bp的條帶,其大小預期理論值一致(圖1) 。

Derf:Dermatophagoidesfarinae;Derp:Dermatophagoidespteronyssinus;Dalb:Dermacentoralbipictus;Dvar:Dermacentorvariabilis;Dand:Dermacentorandersoni;Aame:Amblyommaamericanum;Opar:Ornithodorosparkeri:Rhae:Rhipicephalushaemaphysaloideshaemaphysaloides;Lsta:Lymnaeastagnalis,Rsan:Rhipicephalussanguineus

圖2 ferritin的系統(tǒng)進化樹分析

Fig.2 Phylogenetic relationship of dust mite ferritin

M:DNA marker; 1, 2:PCR product from ferritin.

Fig.3 PCR product of ferritin fromDermatophagoidesfarinae

2.2.2 重組表達載體的構(gòu)建及測序 經(jīng)測序結(jié)果顯示：粉塵螨鐵蛋白基因開放閱讀框為543 bp，編碼179個氨基酸，pI 5.35(圖2)。此粉塵螨鐵蛋白與NCBI公布的粉塵螨鐵蛋白同源性為91%，與屋塵螨鐵蛋白重鏈同源性為86%。將測序正確的鐵蛋白基因連接到pET-32a表達載體后，用BamHⅠ和Hind Ⅲ 雙酶切鑒定陽性克隆，電泳結(jié)果顯示與鐵蛋白的cDNA長度基本一致(圖3)，證明表達重組質(zhì)粒pET32a-鐵蛋白構(gòu)建成功。

2.2.3 鐵蛋白重組蛋白的表達和純化 將含有pET-ferritin 重組表達質(zhì)粒的陽性克隆菌株BL21進行擴培后, 經(jīng)20 μL 1 mol/L IPTG，30℃誘導表達4 h, 將表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE 電泳分析, 結(jié)果顯示約20 kDa處有外源蛋白條帶出現(xiàn),該條帶蛋白的分子量與重組蛋白的理論分子量相符。采用Ni+離子柱親和層析的方法純化重組蛋白(圖4)。

圖4 粉塵螨ferritin的cDNA序列

Fig.4 Sequence of ferritin cDNA fromDermatophagoidesfarinae

M:DNA marker; 1:PET-32a digested withBamHⅠandHindⅢ.

圖5 pET32a-ferritin重組質(zhì)粒的BamHⅠandHindⅢ雙酶切驗證

Fig.5 Restriction identification of recombinant plasmid pET32a-ferritin digested byBamHⅠandHindⅢ

M:Protein marker; 1:Derf-ferritin protein

3 討 論

近幾十年來，全球變態(tài)反應性疾病的發(fā)病率逐年升高[7]，成為危害人類健康的主要問題之一。其中，我國過敏性哮喘患者達1 500余萬,過敏性鼻炎患者超過5 000萬,小兒過敏性哮喘患者達600余萬[8]。粉塵螨是常見的吸入性致敏原之一,據(jù)估計，全球60億人中約有10%的人對塵螨過敏[9]，即約有1.2億人。塵螨變應原的組成成分超過30種，其中主要變應原已制備單克隆抗體，且大部分變應原所具有的酶學性質(zhì)也已被闡明[10]。目前，臨床上對塵螨過敏患者進行診斷和特異性免疫治療仍廣泛使用塵螨粗提物抗原。但由于天然粗提物抗原的組分非常復雜，難以標準化，且容易受外源性有毒物質(zhì)、病原微生物的污染，影響其重復性與安全性[11-12]。而重組變應原疫苗具有純度高、無雜蛋白，易標準化，無外源性毒性物質(zhì)和病原微生物污染等優(yōu)勢[13]。故研究發(fā)現(xiàn)、深入探討變應原組分的免疫學、分子生物學特性及其在粗提浸液中以何種形式發(fā)揮作用，將有助于臨床診治相關(guān)疾病。

MJ Epton等研究發(fā)現(xiàn)塵螨表達的鐵蛋白重鏈誘導的T淋巴細胞增殖反應與Derp 2所誘導的增殖反應具有密切聯(lián)系。鐵蛋白重鏈蛋白可使過敏患者Th1和Th2細胞因子都增高[5]。Shu An等研究發(fā)現(xiàn)塵螨表達的鐵蛋白能與塵螨過敏陽性患者血清中的特異性IgE結(jié)合，皮試陽性率為60%,但沒有完整的基因序列[6]。本文通過對本課題組前期完成的粉塵螨基因組和轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)構(gòu)分析比對，獲得粉塵螨鐵蛋白的基因序列，與NCBI公布的鐵蛋白重鏈基因序列比對，同源性為86%。連接到pET-32a載體上，IPTG誘導表達后，經(jīng)SDS-PAGE分析，表明重組蛋白在宿主大腸桿菌BL21(DE3)中得到了較高效的表達。經(jīng)親和層析純化后,獲得較高純度的重組蛋白。

生物信息學是通過基因序列可預測其相應蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重要工具[14]?；趪H互聯(lián)網(wǎng)的大型基因和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫及相應的軟件，極大方便了基因和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的分析[15]。本文通過運用生物信息學方法對重組鐵蛋白的氨基酸理化參數(shù)、蛋白質(zhì)親疏水性、磷酸化位點、三級結(jié)構(gòu)、同源性等進行分析。預測結(jié)果表明，粉塵螨鐵蛋白含有8個絲氨酸激酶、7個蘇氨酸激酶、7個絡氨酸激酶、0組氨酸激酶磷酸化位點，親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，屬不穩(wěn)定蛋白。為進一步研究粉塵螨過敏原的結(jié)構(gòu)成分及其理化性質(zhì)奠定理論基礎。

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Cloning, expression and purification of dust mite ferritin and its molecular characteristics

LIN Jian-li1,ZHAN Zheng-ke1,LIU Yu-lin2,FAN Xiao-qin3,GENG Xiao-rui3,LIU Xiao-yu1

(1.InstituteofAllergyandImmunology,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China;2.DepartmentofImmunology,MedicalCollege,NanchangUniversity,Nanchang330006,China;3.InstituteofOtorhinolaryngology,ShenzhenUniversity,Shenzhen518020,China)

We obtained recombinant ferritin fromDermatophagoidesfarinae, and analyzed the characterization of the protein. A pair of primers was designed according to the known sequence of ferritin gene. The live mites identified and cultured locally were picked and the total RNA was extracted. The ferritin gene fragment was amplified by RT-PCR, and cloned into pET32a vector, and then transferred intoE.coliTop10. The target gene obtained from the recombinant plasmid by digestion withBamHⅠandHind Ⅲ was connected to the prokaryotic expression vector pET-32a. The expressed recombinant plasmid containing ferritin gene was constructed by cloning target gene into pET-32a and transferred intoE.coliBl21 (DE3). The expressed recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE, and was purified by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC). The ferritin expressed by dust mite was analyzed by the method of bioinformatics. The recombinant plasmid pET32a-ferritin was constructed. SDS-PAGE showed a correct molecular weight of the recombinant ferritin protein. After purification by affinity chromatography, the protein showed only one strip on SDS-PAGE gel. SDS-PAGE showed a band at 20 kD. Dust mite ferritin contains 8 serine kinase, 7 threonine kinase, 7 tyrosine kinase, and 0 histidine kinase phosphorylation sites. Hydrophilic region is larger than the hydrophobic region and it is an unstable protein. In conclusion, the ferritin gene has been cloned and expressed. The purified ferritin has high purity. The study provides a basis for further study of composition and physicochemical properties of house dust mite allergen.

Dermatophagoidesfarinae; ferritin; expression; purification; bioinformatics

Liu Xiao-yu, Email:lxy0901@163.com

國家自然科學基金(No.31328014、31400786)、廣東省高等學校國際暨港澳臺科技合作創(chuàng)新平臺項目(No.2012gjhz0009)、深圳市科技計劃國際科技合作項目(GJHZ20130408174112021)、深圳市科技計劃基礎研究項目(No.JCYJ20130329110735981、JCYJ20120613173233810)、深圳市南山區(qū)研發(fā)項目(No.KC2012JSYB0003A)。

劉曉宇，Email：lxy0901@163.com

1.深圳大學過敏反應與免疫學研究所，深圳 518060； 2.南昌大學醫(yī)學院免疫學教研室，南昌 330006； 3.深圳大學耳鼻咽喉科研究所，深圳 518020

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.007

R384.4

A

1002-2694(2015)10-0927-04

2014-09-24；

2015-08-17

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31328014 and 31400786), the Guangdong Province Colleges and Universities International and Hong Kong, Macao and Taiwan Science and Technology Cooperation Innovation Platform (No. 2012gjhz0009), the Shenzhen Science and Technology Project--International Scientific and Technological Cooperation Project (No. GJHZ20130408174112021), the Basic Research Project of Shenzhen Science and Technology Project (Nos. JCYJ20130329110735981 and JCYJ20120613173233810), the Nanshan District Shenzhen Research and Development Project (No.KC2012JSYB0003A)