韓燁晨，蘇曉菲，王俊武，張 娟，朱昱波，程 佳，員世宇，孫耀貴，王文魁，李宏全，段智變*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2.山西省代縣動(dòng)物檢疫站，代縣 034200；3.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)

復(fù)方中藥對肉雞腹水綜合征肺組織NO、ET-1的作用及機(jī)制

韓燁晨1#，蘇曉菲2#，王俊武1，張 娟1，朱昱波3，程 佳1，員世宇1，孫耀貴1，王文魁1，李宏全1，段智變1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2.山西省代縣動(dòng)物檢疫站，代縣 034200；3.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)

為研究腹水綜合征(AS)肉雞肺組織NO、ET-1及相關(guān)指標(biāo)變化和復(fù)方中藥對其的防治作用，將316羽14日齡羅斯肉雞隨機(jī)分為空白組(N組，常溫，常規(guī)飼養(yǎng))、模型組(C組，9～11 ℃，添加3%豬油和4%魚粉的高能飼料，0.12% Na+飲水飼養(yǎng))和復(fù)方中藥高(T1)、中(T2)、低(T3)劑量組(飼養(yǎng)同C組，每天于飲水中分別給予2、1、0.5 mL·kg-1復(fù)方中藥)以及L-Arg組(L組，飼養(yǎng)同C組，每天于飼料中添加1% L-Arg)。結(jié)果表明：與N組相比，35和45日齡C組肉雞出現(xiàn)典型臨床癥狀，腹水發(fā)病率、腹水心臟指數(shù)和肺組織NO及ET-1含量、iNOS活性、ETARmRNA相對表達(dá)量顯著增加(P<0.01或P<0.05)，肺組織cNOS活性和NO/ET-1顯著降低(P<0.01)；與C組相比，T1、T2和L組均能改善臨床癥狀及上述指標(biāo)(P<0.01或P<0.05)。肉雞肺組織NO及ET-1含量、ETARmRNA相對表達(dá)量和iNOS活性升高，cNOS活性降低，導(dǎo)致NO、ET-1失衡，參與了AS的發(fā)生；氣血雙補(bǔ)、行氣利水的復(fù)方中藥能有效防治AS。

復(fù)方中藥；肉雞腹水綜合征；一氧化氮；一氧化氮合酶；內(nèi)皮素-1；內(nèi)皮素A型受體

腹水綜合征(ascites syndrome，AS)是主要發(fā)生于快速生長期肉雞的一種營養(yǎng)代謝病，寒冷季節(jié)易發(fā)，病因涉及遺傳因素、缺氧、低溫、組織損傷、營養(yǎng)、應(yīng)激和疾病等方面，主要臨床癥狀是腹水、右心肥大、肺和肝充血腫大，死亡率可達(dá)肉雞總死亡率的25%，嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)的發(fā)展。研究表明，改善心肺功能、降低肺血管收縮性阻力，改善雞群管理及環(huán)境條件，合理搭配飼料，嚴(yán)格執(zhí)行防疫制度，在飼料中添加抗氧化藥物[1]、脲酶抑制劑[2]、L-精氨酸[3]等措施可降低AS的發(fā)生率和死亡率，但目前尚沒有預(yù)后良好的治療藥物。

AS發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)，而肺血管舒縮功能異常是PH的直接原因。一氧化氮(nitric oxide，NO)和內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)是血管分泌的重要活性物質(zhì)，其含量及平衡直接決定血管的舒縮功能。研究表明，禽類肺組織深嵌于肋間隙，順應(yīng)性相對較低，同時(shí)，肺組織無肺泡，密布的毛細(xì)血管和毛細(xì)支氣管直接接觸形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，血管充盈度高，血流量有限，肺組織功能與肺組織血管活性物質(zhì)密切相關(guān)[4]。

中藥作為純天然產(chǎn)物，具有低殘留、安全性高、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，在畜禽疾病防治上具有獨(dú)特優(yōu)勢。研究表明，黃芪、當(dāng)歸、丹參、茯苓、大腹皮等傳統(tǒng)中藥能夠通過調(diào)節(jié)NO、ET-1及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性，來調(diào)節(jié)血管舒縮功能[5-13]。本試驗(yàn)通過測定不同日齡AS肉雞肺組織NO、ET-1含量及相關(guān)的NOS活性、內(nèi)皮素特異性A受體(endothelin A receptor，ETAR)相對表達(dá)量，并以黃芪、當(dāng)歸、丹參、茯苓、大腹皮自擬復(fù)方進(jìn)行治療觀察，為AS及其中藥防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理

1日齡羅斯肉雞316羽(雌雄不限)及三段式飼養(yǎng)飼料(購自山西省文水縣大象禽業(yè)有限公司)。試驗(yàn)于11月至次年1月進(jìn)行。常規(guī)育雛至14日齡，健康雞隨機(jī)分為6組(表1)。依據(jù)文獻(xiàn)方法[14-15]，采用低溫(9～11 ℃)、高能飼料(添加3% 豬油、4% 魚粉)、高鈉(飲水總Na+為0.12%)多因素法誘發(fā)肉雞腹水綜合征試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。調(diào)查表明，肉雞腹水綜合征的發(fā)病時(shí)間和病死時(shí)間主要集中在31～45日齡[16]，因此于35、45日齡分別隨機(jī)抽取10羽雞剖取心和肺組織。心臟用于測定腹水心臟指數(shù)，肺組織用于測定NO和ET-1含量、cNOS和iNOS活性及ETARmRNA相對表達(dá)量。

1.2 制備復(fù)方中藥藥劑

以黃芪、當(dāng)歸、丹參、茯苓、大腹皮組方(藥材購自山西省太谷縣藥材公司)，配比依次為3∶2∶2∶2∶1。清水浸泡30 min后煎煮40 min，紗布過濾，收集藥液，重復(fù)3次，合并藥液減壓蒸餾濃縮至1 g·mL-1湯劑，-20 ℃保存?zhèn)溆茫曃骨皽鼗幚怼?/p>

1.3 主要化學(xué)試劑及儀器設(shè)備

NO、NOS試劑盒(南京建成生物工程研究所)，ET-1試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)，Trizol?Reagent 試劑盒(Invitrogen，美國)，SYBR PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒(TaKaRa，日本)，SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa，日本)。Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀(Thermo，美國)，Stratagene Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Stratagene，美國)，ND-1000核酸蛋白測定儀(Nanodrop，美國)，Universal HoodⅡ核酸蛋白成像儀(BIO-RAD，美國)。

表1 試驗(yàn)分組、藥物劑量及飼養(yǎng)方式

Table 1 Groups，drug dose and breeding ways

組別Group樣本數(shù)/只Samples中藥劑量Drugdose溫度/℃Temperature飼喂方式Diet飲水Drinkingwater空白組N52-20～25(常溫)基礎(chǔ)日糧常規(guī)模型組C53-9～11基礎(chǔ)日糧+3%豬油+4%魚粉0.12%Na+高劑組T1522mL·kg-19～11基礎(chǔ)日糧+3%豬油+4%魚粉0.12%Na+中劑組T2531mL·kg-19～11基礎(chǔ)日糧+3%豬油+4%魚粉0.12%Na+低劑組T3530.5mL·kg-19～11基礎(chǔ)日糧+3%豬油+4%魚粉0.12%Na+L-Arg組L53-9～11基礎(chǔ)日糧+3%豬油+4%魚粉+1%L-Arg0.12%Na+

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 AS判定標(biāo)準(zhǔn) 以患雞臨床癥狀(皮膚發(fā)紺，腹部膨大有波動(dòng)感)、剖檢(腹腔內(nèi)有大量膠凍狀液體，肝充血腫大，有血漿凝塊附著)和腹水量(大于20 mL)[17]為判定AS標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.2 腹水心臟指數(shù)(ascites heart index，AHI) 右心室重與全心室重的比值(RV/TV)，取心臟，沿冠狀溝剪去兩心房，清除附著的脂肪組織及血凝塊，稱取全心室重量(TV)，沿前后縱溝剪下右心室(RV)，稱重，計(jì)算AHI[14]。

1.4.3 NO、ET-1含量和cNOS、iNOS活性測定 取0.1～0.2 g肺組織，勻漿機(jī)制備10%勻漿，2 500 r·min-1離心15 min，取上清液，按試劑盒說明測定肺組織NO及ET-1含量和cNOS及iNOS活性。

1.4.4 肺組織ETARmRNA相對表達(dá)量 按Trizol?Reagent試劑盒說明書提取肺組織總RNA，DEPC處理水溶解，電泳檢測RNA完整性，ND-1000核酸蛋白測定儀測定總RNA的質(zhì)量濃度和純度，調(diào)整質(zhì)量濃度至1 000 ng·μL-1左右，-80 ℃保存。按SYBR PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，各樣本取1 000 ng總RNA，以O(shè)ligo(dT)為反轉(zhuǎn)錄引物，合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄體系：Total RNA 1 000 ng，5×Prime?RT Master Mix 6 μL，加去RNA酶雙蒸水至30 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；產(chǎn)物-20 ℃保存。以β-actin為持家基因，根據(jù)GallusgallusETAR基因mRNA序列(NM204119)，應(yīng)用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，并由TaKaRa有限公司合成(表2)。

表2 引物序列、退火溫度及PCR產(chǎn)物長度

Table 2 Primer sequences，annealing temperature and PCR product size

基因Gene引物序列(3'-5')Primersequence退火溫度/℃AnnealingtemperaturePCR產(chǎn)物長度/bpLengthETARForward:AATGGCCCGAATGCACTGATAReverse:CTGCCCAAATTCAGAATCTCCAA58131β-actinForward:ATGAAGCCCAGAGCAAAAGAReverse:GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA58223

取合成的cDNA原液，按2倍梯度稀釋8個(gè)濃度梯度制作β-actin和ETARmRNA基因熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線和熔解曲線，qRT-PCR檢測樣本。反應(yīng)體系及程序參考SYBR?Premix ExTaqTMⅡ試劑盒說明書。反應(yīng)體系為SYBR?Premix ExTaqⅡ10 μL，PCR Forward Primer (10 μmol·L-1) 0.8 μL，PCR Reverse Primer (10 μmol·L-1) 0.8 μL，ROX 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。條件為95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃變性5 s，58 ℃退火及延伸25 s，共50 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本每個(gè)基因重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)病率及腹水心臟指數(shù)(AHI)

試驗(yàn)觀察期間，21日齡時(shí)C組就出現(xiàn)有嚴(yán)重的腹水和心衰竭癥狀的模型雞。發(fā)病肉雞主要表現(xiàn)精神沉郁，冠髯發(fā)紫；下腹部明顯膨大，皮膚變薄發(fā)亮，觸摸有波動(dòng)感，腹腔穿刺有體積30～200mL不等的淡黃色、枯黃色或淡紅色液體；剖解可見心臟肥大松軟，右心室擴(kuò)張，心壁增厚，心包積液；肝淤血、腫大，呈紫紅色，部分雞在肝表面覆蓋有大量膠凍樣黃色滲出物；肺彌散性充血、水腫等。中藥組肉雞臨床癥狀被改善。表3結(jié)果表明，整個(gè)試驗(yàn)過程中C組肉雞腹水綜合征累計(jì)發(fā)病率顯著高于N組(P<0.01)，T1、T2和L組發(fā)病率顯著低于C組(P<0.01)。

表3 肉雞腹水綜合征發(fā)病率

Table 3 Incidence of broilers AS %

N組C組T1組T2組T3組L組發(fā)病率Incidence3.8(2)28.8A(15)7.7B(4)11.3B(6)22.6(12)7.5B(4)

與N組對比，a.P<0.05，A.P<0.01；與C組對比，b.P<0.05，B.P<0.01；下同。括號內(nèi)為該組發(fā)病個(gè)體數(shù)

Compared with group N，a.P<0.05，A.P<0.01；Compared with group C，b.P<0.05，B.P<0.01；The same as below.The number in bracket is individuals with AS in the corresponding group

表4結(jié)果表明，35日齡和45日齡時(shí)，C組肉雞AHI顯著高于N組(P<0.01)，T1、T2和L組AHI顯著低于C組(P<0.01)；45日齡各組AHI趨勢均高于35日齡。

2.2 肺組織NO和ET-1含量

表5結(jié)果表明，35日齡時(shí)，C組肺組織NO和ET-1含量顯著高于N組(P<0.05，P<0.01)，NO/ET-1比值顯著低于N組(P<0.01)；T1、T2和L組NO和ET-1含量顯著低于C組(P<0.05)，T1和L組的NO/ET-1比值顯著高于C組(P<0.05)。45日齡時(shí)，C組肺組織NO和ET-1含量顯著高于N組(P<0.01)，NO/ET-1比值顯著低于N組(P<0.01)；T1和L組ET-1含量顯著低于C組(P<0.05)，T1、T2和L組NO含量顯著低于C組(P<0.05)，T1和L組NO/ET-1比值顯著高于C組(P<0.05)。45日齡各組肺組織NO和ET-1含量趨勢均高于35日齡，NO/ET-1比值趨勢均低于35日齡。

2.3 肺組織NOS活性

表6結(jié)果說明，35日齡和45日齡時(shí)，C組肺組織cNOS活性顯著低于N組(P<0.01)，iNOS活性顯著高于N組(P<0.01)；T1和L組cNOS活性顯著高于C組(P<0.01，P<0.05)，T1、T2和L組iNOS顯著低于C組(P<0.01)。45日齡N和L組

組別Group35日齡35daysofage45日齡45daysofageNO/(μmol·L-1)ET-1/(ng·g-1)NO/ET-1NO/(μmol·L-1)ET-1/(ng·g-1)NO/ET-1N組1.532±0.1011.105±0.2731.360±0.3211.677±0.3161.446±0.1641.156±0.137C組1.736±0.066a1.743±0.182A1.013±0.060A1.793±0.048A1.997±0.209A0.908±0.107AT1組1.601±0.052b1.407±0.264b1.244±0.120b1.703±0.026b1.694±0.139b1.012±0.088bT2組1.593±0.034b1.512±0.108b1.091±0.0331.731±0.025b1.854±0.2600.953±0.150T3組1.723±0.0981.637±0.1821.081±0.0531.782±0.0221.937±0.2310.934±0.127L組1.624±0.092b1.379±0.162b1.216±0.085b1.704±0.024b1.708±0.148b1.005±0.098b

組別Group35日齡35daysofage45日齡45daysofagecNOSiNOScNOSiNOSN組0.3636±0.01640.2772±0.00820.4184±0.03780.3721±0.0120C組0.2696±0.0158A0.3397±0.0076A0.2019±0.0277A0.5064±0.0075AT1組0.3252±0.0182B0.3021±0.0081B0.3134±0.0270b0.4252±0.0114BT2組0.3071±0.01560.3265±0.0062B0.2546±0.02170.4738±0.0084BT3組0.2763±0.01710.3354±0.00940.2237±0.01250.4928±0.0087L組0.3333±0.0135B0.2923±0.0116B0.3431±0.0067b0.4034±0.0121B

肺組織cNOS活性趨勢較35日齡上升，其他組cNOS活性趨勢下降；45日齡各組iNOS活性均較35日齡趨勢上升。

2.4 肺組織ETARmRNA相對表達(dá)量

圖1結(jié)果表明，35日齡和45日齡時(shí)，C組肺組織ETARmRNA相對表達(dá)量顯著高于N組(P<0.01)；T1、T2和L組ETARmRNA相對表達(dá)量顯著低于C組(P<0.01)。45日齡各組ETARmRNA相對表達(dá)量均較35日齡趨勢升高。

圖1 肉雞肺組織ETAR mRNA 相對表達(dá)量Fig 1 Relative expression of ETAR mRNA in lung of broilers

3 討 論

快速生長的肉雞需要大量氧氣來滿足其生理需求，肉雞AS及PH的發(fā)生與缺氧密切相關(guān)[18]。缺氧狀態(tài)下，肺血管舒縮因子異常是形成PH的關(guān)鍵。NO和ET-1是調(diào)控血管舒縮狀態(tài)的一組生物活性因子。生理情況下，NO舒張血管，降低血壓，降低ET-1水平；ET-1收縮血管，升高血壓，促進(jìn)NO釋放。NO和ET-1之間的相互作用決定血管最終的舒縮狀態(tài)。研究表明，缺氧狀態(tài)下，ET-1含量的絕對升高促進(jìn)了PH的發(fā)生發(fā)展[19]，且引起NO的代償性升高[20]。本試驗(yàn)中AS肉雞肺組織NO和ET-1含量均顯著升高、NO/ET-1比值顯著降低，NO和ET-1調(diào)節(jié)的血管舒縮功能失衡參與了AS病變，與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[21-22]，但也有研究表明，缺氧導(dǎo)致AS肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管內(nèi)皮舒張因子產(chǎn)生減少[15]，產(chǎn)生這種差別的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

NOS是合成NO的唯一關(guān)鍵限速酶，NO的含量與NOS活性變化直接相關(guān)[23]。NOS分為原生型(constitutive nitric oxide synthase，cNOS)和誘生型(inducible nitric oxide synthase，iNOS)；cNOS分為神經(jīng)型(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)和內(nèi)皮型(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，AS肉雞肺組織cNOS活性降低、iNOS活性升高，與汪雯翰等[24]研究結(jié)果一致，但也有研究得出相反結(jié)論[25]。研究表明，cNOS在生理?xiàng)l件下產(chǎn)生NO，與ET-1含量相平衡，保持血管狀態(tài)；iNOS于外界刺激后表達(dá)生成大量NO，表現(xiàn)出細(xì)胞毒作用[23]。缺氧引起的PH可導(dǎo)致體內(nèi)cNOS mRNA表達(dá)量下降，iNOS表達(dá)量上升[26]。本試驗(yàn)中，AS肉雞肺組織NO含量顯著升高，而肺組織cNOS活性降低、iNOS活性升高，說明肉雞長期處于刺激NO大量表達(dá)的狀態(tài)，導(dǎo)致組織損傷。

ET-1的縮血管功能通過ETAR特異性介導(dǎo)，ETAR在肺主要分布在肺血管和支氣管的平滑肌細(xì)胞上，介導(dǎo)血管和支氣管的收縮[27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，AS肉雞肺組織ETARmRNA相對表達(dá)量增加，與相關(guān)研究結(jié)果一致[21，28]，缺氧促使內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌ET-1增加，ET-1調(diào)控并結(jié)合位于平滑肌細(xì)胞膜上的ETAR，介導(dǎo)血管收縮[29]，從而促進(jìn)PH發(fā)展。

目前，以補(bǔ)益氣血、活血化瘀、滲濕利水類中藥組方防治AS的研究報(bào)道很多，主要從臨床癥狀、病理學(xué)檢查、體重、發(fā)病率、AHI、血液理化指標(biāo)及抗氧化性能等方面進(jìn)行檢測[30-32]，沒有從血管內(nèi)皮舒縮活性因子NO與NOS、ET-1與ETAR進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道。鐘翠紅等[33]以黨參、黃芪、蒼術(shù)、陳皮、木通、赤芍、當(dāng)歸、茯苓、甘草組方，表明中藥方劑能顯著升高AS肺NO含量，與本試驗(yàn)結(jié)果不一致。本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方中藥能有效改善AS臨床癥狀，顯著降低發(fā)病率和AHI，以及AS肺組織NO、ET-1含量和ETARmRNA相對表達(dá)量，同時(shí)能夠升高肺組織cNOS活性，抑制iNOS活性升高，減輕NO細(xì)胞毒性，減少ET-1作用位點(diǎn)，阻滯其縮血管效應(yīng)，恢復(fù)NO/ET-1比值，保護(hù)肺血管舒縮功能，從而有效防治AS，作用效果與L-Arg類似[34-35]，其功效與該方中藥配伍的協(xié)同作用及整體調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

中獸醫(yī)學(xué)分析肉雞腹水綜合征的證候特征是氣血雙虛、氣血瘀滯、水濕停聚。氣血雙虛，則肝主疏泄、心主血脈、脾主運(yùn)化、肺主氣主宣降、腎主水的功能失調(diào)，引發(fā)氣血瘀滯、水濕停聚。根據(jù)中獸醫(yī)治則，確立治法為補(bǔ)益氣血、行氣活血、利水滲濕；根據(jù)中藥藥性，黃芪益氣生精，固本補(bǔ)血；當(dāng)歸補(bǔ)血行血，補(bǔ)虛通絡(luò)；丹參活血通經(jīng)，祛瘀通脈；茯苓滲濕利竅，逐水化氣；大腹皮行氣導(dǎo)滯，利水消腫，故選配黃芪、當(dāng)歸、丹參、茯苓、大腹皮等組成中藥復(fù)方。

研究表明，黃芪能夠降低缺氧引起的NO釋放增加，抑制NOS活性，保護(hù)血管[5]，還可緩解缺血引起的ET含量升高，舒張血管[6]；當(dāng)歸能整體調(diào)節(jié)缺血組織的NOS活性和NO水平，干擾NO引起的細(xì)胞毒性作用[7]，有效成分阿魏酸鈉能抑制缺氧引起的ET-1含量升高，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[8]；丹參可抑制NO的負(fù)性作用，調(diào)控NOS活性，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[9]，而且能下調(diào)缺血及缺氧組織的ET水平[10]，優(yōu)化NO/ET比例，保護(hù)組織[11]；茯苓主要成分茯苓酸可下調(diào)毒素誘導(dǎo)血管內(nèi)皮分泌的NO和ET-1，使其含量接近正常水平[12]；大腹皮具有抑制毒素誘導(dǎo)iNOS活性的作用[13]。本試驗(yàn)中，復(fù)方中藥能夠提高內(nèi)皮源性NO水平，抑制iNOS合成大量NO造成的病理損害，抑制ET的合成分泌從而抑制血管收縮，降低肺動(dòng)脈壓，從而有效防治AS。

中藥及復(fù)方中藥的多種活性成分單獨(dú)或協(xié)同作用于組織細(xì)胞的多種受體，通過多重信號通路整體調(diào)節(jié)機(jī)體功能，發(fā)揮其藥理作用。關(guān)于本試驗(yàn)復(fù)方中藥對AS防治作用分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

[1] BOTTJE W，ENKVETCHAKUL B，MOORE R，et al.Effect of alpha-tocopherol on antioxidants，lipid peroxidation，and the incidence of pulmonary hypertension syndrome (ascites) in broilers[J].PoultSci，1995，74(8)：1356-1369.

[2] BALOG J M，ANTHONY N B，WALL C W，et al.Effect of a urease inhibitor and ceiling fans on ascites in broilers.2.Blood variables,ascites scores,and body and organ weights[J].PoultSci，1994，73(6)：810-816.

[3] SAKI A，HAGHIGHAT M，KHAJALI F.Supplemental arginine administered in ovo or in the feed reduces the susceptibility of broilers to pulmonary hypertension syndrome[J].BrPoultSci，2013，54(5)：575-580.

[4] FEDDE M R.Relationship of structure and function of the avian respiratory system to disease susceptibility[J].PoultSci，1998，77(8)：1130-1138.

[5] YIN Y Y，LI W P，GONG H L，et al.Protective effect of astragaloside on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats[J].AmJChinMed，2010，38(3)：517-527.[6] 黑子清，張勁軍，林世清，等.黃芪注射液對大鼠失血性休克再灌注腸黏膜NO和ET的影響[J].中國中藥雜志，2004，29(5)：444-447. HEI Z Q，ZHANG J J，LIN S Q，et al.Effects ofAstragalusmembranaceusinjection on nitric oxide and endothelin concentration of intestinal mucosa after hemorrhage shock-reperfusion in rats[J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica， 2004，29(5)：444-447.(in Chinese)

[7] HOU Y Z，ZHAO G R，YANG J，et al.Protective effect ofLigusticumchuanxiongandAngelicasinesison endothelial cell damage induced by hydrogen peroxide[J].LifeSci，2004，75(14)：1775-1786.

[8] 陳莉芬，陶 陶，余 震，等.阿魏酸鈉對缺氧致腦血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB、IκBα表達(dá)的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29(3)：228-230. CHEN L F，TAO T，YU Z，et al.Effect of sodium ferulate on the expression of NF-κB and IκBα in rat brain microvascular endothelial cells injured by hypoxia[J].ActaAcademiaeMedicinaeMilitarisTertiae，2007，29(3)：228-230.(in Chinese)

[9] 李永勝，王照華，嚴(yán) 麗，等.丹參酮ⅡA對大鼠肥厚心肌NO產(chǎn)生及eNOS基因表達(dá)的影響[J].中國中藥雜志，2008，33(12)：1446-1450. LI Y S，WANG Z H，YAN L，et al.Effect of tashinone on nitric oxide synthase in hypertrophic cadiocyte of rats suffered abdominal aorta constriction[J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica，2008，33(12)：1446-1450.(in Chinese)

[10] 孫 瑛，高詠梅，朱廣瑾.丹參提取物單體對腫瘤壞死因子誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞組織因子表達(dá)的干預(yù)作用[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2003，23(6)：634-638. SUN Y，GAO Y M，ZHU G J.Intervenient effect of 764-3 on TF expression induced by tumor necrosis factor-α in endothelial cells[J].BasicMedicalSciencesandClinics，2003，23(6)：634-638.(in Chinese)

[11] 晏 澤，肖能坎，劉 卉，等.丹參提高燙傷創(chuàng)面組織活力的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，1999，8(7)：1042-1044. YAN Z，XIAO N K，LIU H，et al.Experimental study of Salvia miltiorrhiza improving burn wound tissue vitality [J].ModernJournalofIntegratedChineseTraditionalandWesternMedicine，1999，8(7)：1042-1044.(in Chinese)

[12] 周宏超，高立云，范光麗，等.茯苓酸對SLT-Ⅱe誘導(dǎo)大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38(10)：884-888. ZHOU H C，GAO L Y，F(xiàn)AN G L，et al.Effects of pachymic acid on the secretion of cytokines from rat intestinal microvascular endothelial cells induced by SLT-Ⅱe[J].ChineseVeterinaryScience，2008，38(10)：884-888.(in Chinese)

[13] 朱金照，張 捷，許其增，等.中藥大腹皮抑制腸道內(nèi)毒素移位中iNOS、SP的作用[J].世界華人消化雜志，2002，10(6)：659-662. ZHU J Z，ZHANG J，XU Q Z，et al.Inhibitory role of iNOS and SP in intestinal endotoxin translocation induced by pericarpium arecae in rats[J].WorldChineseJournalofDigestology，2002，10(6)：659-662.(in Chinese)

[14] JULIAN R J.The effect of increased sodium in the drinking water on right ventricular hypertrophy，right ventricular failure and ascites in broiler chickens[J].AvianPathol，1987，16(1)：61-71.

[15] 何 誠，趙德明，梁禮成.低溫高能日糧對肉雞肺動(dòng)脈和腹水癥的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，31(1)：34-40. HE C，ZHAO D M，LIANG L C.The effect of cold stress and high energy diets on pulmonary artery and ascites[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2000，31(1)：34-40.(in Chinese)

[16] MAXWELL M H，ROBERTSON G W.UK survey of broiler ascites and sudden death syndromes in 1993[J].BrPoultSci，1998，39(2)：203-215.

[17] LI K，ZHAO L H，GENG G R，et al.Increased calcium deposits and decreased Ca2+-ATPase in erythrocytes of ascitic broiler chickens[J].ResVetSci，2011，90(3)：468-473.

[18] JULIAN R J，MIRSALIMI S M.Blood oxygen concentration of fast-growing and slow-growing broiler chickens，and chickens with ascites from right ventricular failure[J].AvianDis，1992，36(3)：730-732.

[19] SPINELLA F，ROSANL，DI CASTRO V，et al.Endothelin-1-induced prostaglandin E2-EP2，EP4 signaling regulates vascular endothelial growth factor production and ovarian carcinoma cell invasion[J].JBiolChem，2004，279(45)：46700-46705.

[20] TSURUMI Y，MUROHARA T，KRASINSKI K，et al.Reciprocal relation between VEGF and NO in the regulation of endothelial integrity[J].NatMed，1997，3(8)：879-886.

[21] 周東海.內(nèi)皮素-1及其受體、受體拮抗劑在肺動(dòng)脈高壓綜合征肉雞中的作用研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005. ZHOU D H.The Effects of Endothelin-1 and ETAR，ETA receptor Antagonist BQ123 on Pulmonary Hypertension Syndrome in Broiler[D].Wuhan：Huazhong Agricultural University，2005.(in Chinese)

[22] 李家奎，郭定宗，吳建光，等.肺動(dòng)脈高壓肉雞和腹水肉雞血清、肝、肺等組織NO含量及某些酶活性的變化[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，19(5)：478-480. LI J K，GUO D Z，WU J G，et al.Study on content of nitric oxide of plasma，liver，lung and change in some enzyme of broilers with high pulmonary arterial pressure and ascites[J].JournalofHuazhongAgriculturalUniversity，2000，19(5)：478-480.(in Chinese)

[23] FAGAN K A，TYLER R C，SATO K，et al.Relative contributions of endothelial，inducible and neuronal NOS to tone in the murine pulmonary circulation[J].AmJPhysiol，1999，277(3 Pt 1)：L472-478.

[24] 汪雯翰，郭定宗，楊世錦，等.肺動(dòng)脈高壓綜合征發(fā)病過程中肉雞血清和肺臟iNOS和cNOS活性變化[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37(7)：711-716. WANG W H，GUO D Z，YANG S J，et al.Activity of iNOS and cNOS in serum and lung of broilers with pulmonary hypertension syndrome[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2006，37(7)：711-716.(in Chinese)

[25] MORENO DE SANDINO M，HERNANDEZ A.Nitric oxide synthase expression in the endothelium of pulmonary arterioles in normal and pulmonary hypertensive chickens subjected to chronic hypobaric hypoxia[J].AvianDis，2003，47(4)：1291-1297.

[26] PALMER L A，SEMENZA G L，STOLER M H，et al.Hypoxia induces type II NOS gene expression in pulmonary artery endothelial cells via HIF-1[J].AmJPhysiol，1998，274(2 Pt 1)：L212-L219.

[27] SAKURAI T，YANAGISAWA M，MASAKI T.Molecular characterization of endothelin receptors[J].TrendsPharmacolSci，1992，13(3)：103-108.

[28] 劉文菊，喬 健，歐德淵，等.2種組胺受體拮抗劑對低溫誘發(fā)的肉雞肺動(dòng)脈高壓的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36(4)：407-411. LIU W J，QIAO J，OU D Y，et al.Effects of two histamine receptor antagonists on pulmonary hypertension in broiler chickens[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2005，36(4)：407-411.(in Chinese)[29] HASSANPOUR H，TESHFAM M，MOMTAZ H，et al.Up-regulation of endothelin-1 and endothelin type A receptor genes expression in the heart of broiler chickens versus layer chickens[J].ResVetSci，2010，89(3)：352-357.

[30] 王小娥，劉愛玲，蘇建東，等.參芪顆粒預(yù)防肉雞腹水綜合征的研究[J].中國獸藥雜志，2010，44(6)：19-22. WANG X E，LIU A L，SU J D，et al.Studies on preventive effects of Shenqi Granules on broilers′ ascites syndrome[J].ChineseJournalofVeterinaryDrug，2010，44(6)：19-22.(in Chinese)

[31] 喬 健，李樹春，李連海，等.復(fù)方中藥哈特維(腹水消)對肉雞腹水綜合征的預(yù)防作用研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，3(3)：113-116. QIAO J，LI S C，LI L H，et al.Prophylaxis of ascites syndrome in broiler chicken by using Chinese herbal medicine[J].JournalofChinaAgriculturalUniversity，1998，3(3)：113-116.(in Chinese)

[32] 王文魁，齊永華，程 佳，等.苓桂術(shù)甘湯對肉雞腹水綜合征的防治作用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36(11)：1215-1222. WANG W K，QI Y H，CHENG J，et al.The Preventive effect of LGZG Tang on ascites syndrome of broiler[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2005，36(11)：1215-1222.(in Chinese)

[33] 鐘翠紅，張永英，郝麗梅，等.復(fù)方中藥對腹水癥肉雞肝肺血清NO含量和mPAP的影響[J].中國獸醫(yī)雜志，2007，43(7)：56-57. ZHONG C H，ZHANG Y Y，HAO L M，et al.Compound traditional Chinese medicine on ascites in broiler liver lung and serum NO levels impact mPAP[J].ChineseJouranlofVeterinaryMedicine，2007，43(7)：56-57.(in Chinese)

[34] 譚 勛，潘家強(qiáng)，李錦春，等.L-精氨酸對肺動(dòng)脈高壓肉雞肺動(dòng)脈NOS活性的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28(3)：79-82. TAN X，PAN J Q，LI J C，et al.Effect ofL-arginine on activity of NOS in pulmonary arterioles in broilers with pulmonary hypertension induced by cold temperature[J].JournalofNanjingAgriculturalUniversity，2005，28(3)：79-82.(in Chinese)

[35] MARTINA V，MASHA A，GIGLIARDI V R，et al.Long-term N-acetylcysteine and L-arginine administration reduces endothelial activation and systolic blood pressure in hypertensive patients with type 2 diabetes[J].DiabetesCare，2008，31(5)：940-944.

(編輯 白永平)

The Effect and Mechanism of the Compound Recipe of the Traditional Chinese Medicine on NO，ET-1 in Lung of Broiler with Ascites Syndrome

HAN Ye-chen1#，SU Xiao-fei2#，WANG Jun-wu1，ZHANG Juan1，ZHU Yu-bo3，CHENG Jia1，YUN Shi-yu1，SUN Yao-gui1，WANG Wen-kui1，LI Hong-quan1，DUAN Zhi-bian1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；2.AnimalQuarantineStationofDaixianofShanxi，Daixian034200，China；3.CollegeofAnimalScinece，HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang453003，China)

The objective of this study was to investigate the changes of the contents of nitric oxide (NO) and endothelin-1 (ET-1)，and the related items in lung of broilers with ascites syndrome (AS) and the prevention and treatment of the compound recipe of the traditional Chinese medicine on AS.A total of 316 14-day-old Ross broilers were randomly divided into normal group (N，bred with a standard diet at room temperature)，control group (C，bred with high-energy diet derived from standard diet added with 3% lard and 4% fish meal and 0.12% Na+in drinking water at 9-11 ℃ to induce AS)，compound recipe of the traditional Chinese medicine groups (T1，T2，T3，bred in the same way as group C except a dose of 2，1，0.5 mL·kg-1bw of the traditional Chinese medicine everyday added in drinking water，respectively)，and L-arginine group (L，bred in the same way as group C except 1% L-arginine added in diet).The results showed that the broilers in group C presented the typical clinical symptoms of AS at 35 and 45 days of age.Compared with group N，the incidence of AS，ascites heart index (AHI)，the contents of NO and ET-1，iNOS activity and the relative expression amount ofETARmRNA in lung of broilers at 35 and 45 days of age in group C were increased significantly (P<0.01 orP<0.05)，and cNOS activity and the ratio of NO to ET-1 were decreased significantly (P<0.01) in group C.The clinical symptoms and items mentioned above were all improved in groups of L，T1 and T2 compared with group C (P<0.01 orP<0.05).The study showed that the increases of NO and ET-1 content，ETARmRNA relative expression amount and iNOS activity and the decrease of cNOS activity in lung of broiler induced the unbalance of NO and ET-1 which participated in the pathogenesis of AS.The studied compound recipe of the traditional Chinese medicine with the role of tonifying qi-blood and activating qi to excrete water can prevent and treat AS of broiler effectively.

compound recipe of the traditional Chinese medicine;ascites syndrome;nitric oxide;nitric oxide synthase；endothelin-1;endothelin A receptor

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.023

2015-01-13

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140311022-1)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)橫向科技項(xiàng)目(2013HX28)

韓燁晨(1992-)，女，黑龍江雙鴨山人，碩士生，主要從事中藥防治動(dòng)物血管病變研究，E-mail：hanyechen1992@163.com；蘇曉菲(1989-)，女，山西忻州人，主要從事動(dòng)物檢疫研究，E-mail：903451453@qq.com。韓燁晨和蘇曉菲同為第一作者

*通信作者：段智變(1969-)，女，山西祁縣人，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中獸醫(yī)藥對動(dòng)物血管病變及脾胃病證研究，E-mail：duanzhibian2008@aliyun.com

S853.33

A

0366-6964(2015)06-1055-08